固定化金属亲和层析实验

IMAC的应用

1. 检测和固定

在寻求利用 H i s 标 记 蛋 白 质 与 固 定 化 金 属 离 子 的 特 异 性 和 髙 亲 和 性 的 过 程 中 ，IMAC 配基已被应用于蛋白质与蛋白质之间的相互作用, 其中蛋白质必须稳定地固定在表面上。下面简要描述包括酶联免疫吸附实验(ELISA) 和芯片技术在内的两个应用，其
中 ELISA用做诊断工具, 芯片技术用于功能分析。

N i - N T A 配基吸附到微孔板表面, 用 于 固 定 可 溶 且 结 构 完 整 的 H i s 标 记 抗 原 ，进行血清学研 究 。利 用 H i s 标记的 直 接 固 定 化 比 标 准 E L I S A 有 优 势 。标 准 E L I S A 是将蛋白质随机吸附到塑料表面，这会造成蛋白质结构破坏，隐藏部分蛋白质表面及抗体可能结合的位 点 。相 比 之 下 ，以 I M A C 为 基 础 的 E L I S A 可 以 筛 选 构象依赖性单克隆抗体(Padan etal.， 1998), 增加免疫吸附检测灵敏性 (Jinet al.， 2004) 。

将 H i s 标记蛋白质固定于芯片表面用于研究与其他分子的相互作用(如 通 过 S P R ) ，是一种应用广泛的蛋白质鉴定方法。 「稳定性」是降低固定分子「渗出 」的重要因素。基于上述 适 于 结 合 的 特 性 ，N T A 配 基 常 用 于 固 定 (Knecht etal.， 2009; Nieba etal.， 1997) 。但 是 ，生物素化蛋白与链霉亲和素包被载体的相互作用被认为更加稳固。根据多价螯合头 (multivalent chelator head)概念——仅一个配基上即可载有 3 个 N T A 基 团 ，对于玻璃表 面 固 定 的 H i s 标 记 蛋白质来说，即使在低浓度状态下，也 可 保 证 固 定 功 能 的 稳 定 性 ，这是一个巨大的进步(tris-NTA;Lata and Piehler， 2005; Zhaohua et al.， 2006) 。这一进步提供了一个能够替代链霉亲和素/生物素蛋白为基础的固定方式，并且在下面的纯化过程中 ，可 以 使 用 H i s 标 记 蛋 白 质 ，不 需 要生物素化。我 们 已 经 合 成 tris-NTA配 基 ，并将其与磁性琼脂 糖 珠 偶 联 , 以测试这种方法是否可以应用于 H i s 标 记 蛋 白 质 的 纯 化 ，这样也许可以实现更加特异地、从 复 杂 样 品 中 的 单 步 回 收 。初 步 数 据 (图 27. 3)表 明 ，事实可能确实如 此 。应用两种介质从草地夜蛾来源的无细胞裂解反应中分离的A K T l 激 酶 ，其 中 trisN i - N T A 珠纯化后纯度略高。这些研究结果是否具有普遍性，以 及 tris-NTA 层析方法是否可以大规模商品化仍有待评估。

IMAC 配基也已成功替代抗体作为指示剂, 用于多种类型的免疫印记。将 H is 标记蛋白质转移到硝酸纤维素膜上, 通过Ni-N T A 与碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶偶联，进行显色或化学发光反应检测 (Lv et al.，2003)，或者与量子点偶联进行荧光检测(Kim etal.， 2008)。 这意味着在不要求高特异性的情况下，其可以替代抗体检测法成为一种快速而且经济的选择，并因此受到欢迎。 tris-N T A 偶联物的出现提高了 N T A 偶联检测法的特异性（Lata et al.， 2006 ;Reichel et al.， 2007)。

2. 蛋白质组分的纯化

最 初 ， I M A C 的 研 发 是 针 对 含 金 属 离 子 和 组 氨 酸 的 蛋 白 质 的 一 种 基 团 分 离 方 法CPorathetaL ,1975)。现 在 将 I M A C 的 这 些 功 能 用 于 蛋 白 质 组 学 研 究 。在蛋白 质 组 学研 究 中 ，为 保 证 低 丰 度 蛋 白 质 分 析 灵 敏 性 ，降 低 系 统 (蛋 白 质 组 )复 杂 度 是 必 不 可 少 。因
此 ，蛋白质组学越来越多地使用预分离方法对检测过程中可能丢失的蛋白质进行浓缩，如液 相 、反 相 、离子交换和亲和色谱(如 I M A O C L o o , 2003; StasykandHuber, 2004)。最近 ，已 经 有 I M A C 应 用 于 蛋 白 质 组 学 方 面 的 综 述 (Sun et al.， 2005) ，主要是磷酸化蛋白质 、磷酸化肽和金属结合蛋白质的浓缩。在浓缩像细胞裂解液或血液这样的复杂样品时，使 其 流 过 I M A C 介 质 再 经 清 洗 ，继 而 通 过 不 同 p H 或高浓度的咪唑洗脱目的组分, 然后用
质 谱 法 ( M S ) 分 析 洗 脱 组 分 ，或者经二维凝胶电泳进一步分离后用M S 法或液质谱联用法( L C - M S ) 分 析 。

Fe³⁺ 、A1³⁺和 Ga³⁺ 是研究磷酸化蛋白质的优选离子，通 常 将 其 固 定 于 IDA。 适用于金 属 蛋 白 质 组 学MAC分 析 的 离 子 是 铜 、镍 、锌 和 铁 元 素 ，这 些 都 是 生 命 必 需 元 素 。金属蛋白质组是指一组具有金属结合能力的蛋白质，并且最近已经有了 一些关于这种蛋白质组学方面的综述(Shi and Chance， 2008; SunetaL, 2005) 。可以利用这些金属结合蛋白质 与 某 种 固 定 化 Me²⁺结 合 的 能 力（如 Me²⁺-NTA)，或 是 利 用 在 不 带 电 荷 的 IMAC 配基( 如 NTA)上 捕 捉 Me²⁺ , 与 其 结 合 形 成 Me²⁺-蛋白质的 能 力 ，达到浓缩的目的。

蛋 白 质 组 的 I M A C 芯片分析方法也有报道(Slentz et aL， 2003) ，并且可以作为临床筛查含磷酸化基团和组氨酸的蛋白质及多肽的工具( S E L D I - I M A C ) 。

潜在结合位点(磷 酸 基团中的氧、碱中的氮和氧、核苷酸中的经基)与固定化金属离子之间亲和作用的差 异 性 是 一 种 复 杂 的 现 象 ，这 种 现 象 是 I M A C 用 于 结 合 和 分 离 单 、双或更多聚合形式核苷酸的基础(Hubert and Porath, 1980; 1981) 。

抗体与固定化金属离子的亲和相互作用可以应用于IM A C分离技术，这是一种完全不同的基团特异性分离方法。重链内部的金属离子结合位点是这种相互作用的分子基础(H ale and Beidler, 1994)，并且已经对抗体中组氨酸残基的排列形式进行了分析(p orathand Olin，1983)。许多作者曾报道了不同来源免疫球蛋白与 IM A C介质的吸附(人IgG,Porath and Olin，1983; 人 源 化 小 鼠 IgG ， Hale and Beidler，1 9 9 4 ; 山羊 IgG ， Bodene t a l.，1995)。已成功使用多种形式IM A C 纯化抗体，包括凝胶(H ale and Beidler, 1994;Vancan e ta l.，2002)、甲 基 丙 嫌 酸 酯 聚 合 物（Mfeszdrosovd et al.，2003) 和中空纤维柱(S e rp a e ta l.，2 〇 05)。与传统的P ro tein A /P ro te in G 层析相比，盐洗脱性质温和、成本低及 IM A C介质的耐用性，都成 为 IM A C方法的优点(Serpa et al.，2005)。

要想完整概括IM A C配基的应用，就 要 提 到 Chelex法 。经 典 的 IM A C 法是利用过渡金属离子的亲和力，通过固定化金属离子纯化肽/多肽。与传统方法不同，C helex阐述了一种核酸样品制备方法, 利用该技术耗尽样本中P C R 金属离子抑制剂后再用于下面的步骤 (W d s h e t al.，1991)。类 似 于 IDA，不带电荷的配基与常用的琼脂糖介质偶联，即为Chelex树脂 (如 Bio^Rad Chelex 100)。程序简单概括如下: 有/无 蛋 白 酶 K 条件下，将血液或组织样本与Chelex树脂一同孵育，然后分离含有核酸的上清液和树脂颗粒。获得的核酸组分虽然纯度不髙，但已经从样本中去除金属离子，因此适合用于P C R 扩增 ，否则高温下可能催化裂解DNA，进而抑制 P C R 反应。 Chele x 法快速、廉 价 ，因此主要用于对活检和穿刺获得的少量样本进行的小片段DNA扩增(GarciaGonzAlez et al.，2004; Gill etal.，1992)。

3. H i s 标记蛋白质的纯化

H is 标签及其对蛋白质表达的影响

IM A C最重要的应用是纯化 H is 标记重组蛋白，融 合 表 达 的 H is 标 签 为 含 有 6 个或更多组氨酸残基的片段(图 27.1)。 H is 标签具有相当高的亲和力和特异性, 因此在大多数情况下， IMAC —步纯化足以制备一定纯度的目标蛋白质，且可满足很多应用的要求。标签的结构(即位置、顺序和长度)可以从多个水平影响蛋白质生产: 表达率、与 IM A C 配
基的结合能力、蛋白质三维结构、蛋白质晶体的形成等，而且其虽然对溶解度和活性影响轻 微 ，但也有一定作用。 H is 标签最常见的形式是由6 个连续的组氨酸残基(H 6)组 成 ，可以提供6 个金属结合位点。大多数情况下，结合/解离平衡转换能力越高，使平衡倾向于结合的方向，越可能具有稳定的结合能力(表 27. l ;K nech t e t a L ，2009)。 Biacore检测结果显示，在 pH 7. 0〜7. 4 时 ，六聚组氨酸标记蛋白质与Ni-N T A 的解离速率为 I X l O⁶〜1.4X 10⁸(K n e c h te ta l.，2009;N ie b a e ta l.，1997)。然而 ，平面芯片表面的流动性、配体密度和蛋白质浓度与多孔隙琼脂糖颗粒非常不同。此外， H is 标记蛋白质与 IM A C 配基相互作用的稳定性受标签的可接近程度和蛋白质表面全部螯合残基(组氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和谷氨酸)数量的影响（Bolanos-Garcia and Davies, 2006; Jensen et al.，2004)，因此在很大程度上这种相互作用是独立的。也就是说，通常即使在苛刻的条件下，如果H is 标签是易接近的(大多数情况下均是如此），那么对于柱层析，蛋白质与 Ni-T N A 的亲和 力（或 称 为 活 性 更 合 适 ) 也 是 足 够 高 的 。表 2 7 . 1 列 出 了 文 献 报 道 过 的 标 签 序 列 ，以及最 近 在 我 们 实 验 室 测 试 的 一 些 未 发 表 的 标 签 序 列 。

与 可 溶 性 蛋 白 的 「标 准 」纯 化 相 比 ，在 表 面 活 性 剂 存 在 的 情 况 下 ，回 收 膜 蛋 白 遇 到 的 情况 是 不 同 的 (见 本 章 2. 1 0 节 ），因 为 表 面 活 性 剂 胶 粒 可 能 会 部 分 或 完 全 覆 盖 HiS标 签 。这种 情 况 下 ，需 要 使 用 更 长 的 标 签 序 列 或 通 过 连 接 物 ，使 IMAC 树 脂 与 蛋 白 质 结 合 (M0 hanty and Wiener，2004)。表 2 7 . 1 所 示 为 推 荐 使 用 的 各 种 长 度 H is 标 签 以 及 包 含 其 他 可 选序 列 的 H is 标 签 ，并 且 已 经 改 善 了 这 些 标 签 与 IM AC 树 脂 的 结 合 能 力 。但 是 ，无 论 是 对于 我 们 还 是 其 他 实 验 室 (Knecht et al.，2009)，这 些 改 进 标 签 的 应 用 价 值 都 不 能 超 过 经 典的 H n 标 签 。研 究 表 明 ，比 标 签 序 列 本 身 更 重 要 的 就 是 其 结 合 位 置 (N 端 或 C 端 )以 及 在N 端 的 氨 基 酸 序 列 。据 报 道 ,N 端 邻 近 甲 硫 氨 酸 的 氨 基 酸 的 作 用 在 于 防 止 N 端 甲 硫 氨 酸加 工 ，对 于 一 般 的 大 肠 杆 菌 (Dalb0 g e e t a L , 1990; H ir ele ta l., 1989)蛋 白 质 表 达 率 有 积极 作 用 。通 过 我 们 和 其 他 研 究 者 对 这 些 报 告 的 评 估 , 确 认 赖 氨 酸 和 精 氨 酸 位 于 蛋 白 质 N端 的 第 二 位 时 ，具 有 这 种 效 果（Pedersen et al.，1999; SchMer et al.，2002 a ; Svensson etal.，2006)。然 而 ，N 端 HiS(Strep n )标 签 的 髙 成 功 率 , 不 仅 源 于 第 二 个 氨 基 酸 对 表 达 的刺 激 作 用 ，似 乎 也 因 为 该 位 置 的 标 签 序 列 会 持 续 影 响 翻 译 起 始 区 的 mRNA结 构 。通 过 分析 蛋 白 质 的 表 达 水 平 和 溶 解 性 ，对 细 菌 和 真 核 生 物 表 达 的 几 种 蛋 白 质 进 行 了 N 端 和 C 端HiS(Strep II)标 签 位 置 比 较 (图 27. 4) 。在 大 多 数 情 况 下 ，N 端 标 签 更 利 于 蛋 白 质 表 达 。

mRNA 5’区 的 系 统 研 究 表 明 ，通 常 翻 译 起 始 区 形 成 的 发 夹 结 构 因 阻 止 核 糖 体 与mRNA结 合 而 导 致 低 表 达 (Cdbe and Geiser，2006)。采 用 序 列 优 化 破 坏 发 夹 结 构 稳 定 性可 以 改 善 表 达 。当 蛋 白 质 N 端 表 达 Hf 5 标 签 时 , 可 以 获 得 类 似 的 结 果 。如 图 27. 4 所 示 ，产 生 这 种 效 果 的 原 因 在 于 , 可 以 保 护 翻 译 起 始 区 mRNA二 级 结 构 的 启 动 子 功 能 。其 他 研究 者 也 观 察 到 了 类 似 的 结 果（Busso et al_，2003; Svensson et al.，2006)，这 可 能 是 N 端H is 标签具有吸引力的原因。然而在某些情况下，C 端 H is 标签对蛋白质的表达率和溶解度有更明显的效果，如 IRAK4(图 27. 4)。最近报道的在大肠杆菌中表达昆虫毒素, 也观察到了类似的效果，其 C 端 H is 标 签 表 达 形 式 具 有 更 高 的 溶 解 度 和 热 稳 定 性（Xu
e t a l .，2008)。作者认为 C 端标签可以稳定蛋白质的整体结构。其他研究团队发现，与无标签蛋白质相比，H is 标签会使溶解度略有下降，但 与 C 端融合时可提髙蛋白质产量CW oestenenketal.，20〇4)。总而言之, 这些数据提示，蛋白质的 N 端 和 C 端标记突变体虽然不一定能够合理表达蛋白质、提高重组蛋白的量，但至少可以增加机会。将标签放置于 C 端 ，可以避免干扰膜运输，保证蛋白质分泌表达。

4.用 I M A C 纯化蛋白质的基本考虑

与其他亲和层析相比，IM A C纯 化 H is 标记蛋白质有几个优势, 正因如此，IM A C 成为应用最广泛的层析技术(Biocompare，2006; Derewenda, 20〇4)。除了成本低廉和使用简 便 ，IM A C 的耐用性无疑是其最突出的特点:① H is 标签与配基在非变性或如8 m ol/L尿 素 或 6 mol/L 盐酸胍等变性条件下均可以发生相互作用(Hochuli; 1988), 继而原位折叠 (Jungbauer et al.，2004);②氧化还原条件亦然;③蛋白质结合能够广泛耐受各种类型的化学物质(表27.1总结了 Ni-NTA IM AC的化学兼容性和局限性) • ，④即使在高蛋白质浓度条件 下 ，M A C 的高亲和力和特异性也可以实现髙捕获率;⑤纯化工艺具有可放大性。

尽 管 IM A C具有广泛的兼容性，但有其局限性。显然，螯合试剂本身就是一个缺点，要避免使用。例如，EDTA，是一种髙效金属蛋白酶抑制剂，只能在低浓度应用。并且需要避免使用可能具有螯合作用的基团，如 T ris、铵盐及某些氨基酸 (表27.2)。

直到最近才关注到一个问题，即 IM A C使用的强还原剂 (如D TT) ，会将镍还原, 因而可能导致蛋白质制剂中镍浓度增加。然 而 ，我 们 发 现 中 等 浓 度 的 D T T 完全可以用于N T A 纯化。如 图 27. 5A 所 示 ， D T T 浓度达到10 mmol/L 时 ， HIV -1反转录酶(RT) 的纯(未提供数据)显示 ，高浓度重金属离子未产生抑制效应。尽 管 D T T 可能会还原镍离子，使凝胶柱床颜色改变，但是配基上镍离子的浸出不会增加（图 27. 5A )，还原条件下处理树脂后, 可以使其重复使用和再生(未提供数据)。研究结果提示， D TT 会还原镍而引发树脂颜色变化，但树脂仍保有其功能。目前TCEP越来越多地替代D T T 和 疏 基 乙 醇(β-ME) 用于M A C 纯化, 它是一种无味、不含巯基的还原剂，对还原二硫键更具有选择性,且在水溶液中更稳定。我们建议Ni-NTA柱层析中TCEP使用浓度为 1〜5 mmol/L。

5. IMAC应用于蛋白质共纯化，如何实施

多数情况下, 通过一步IMAC纯化，即可得到纯度很髙的蛋白质（图 27. 2 A 、D、E 和图 27. 5 A;Bornhorst and Falke，2000; Schmitt et al.，1993)。层析中使用的 IMAC 树脂量与样品中需要纯化的His 标记重组蛋白量是相关的, 两者的关系越近，蛋白质纯度越高。原因在于，那些天然具有能与金属离子相互作用的表面基序蛋白质也可能与树脂结合。与可折叠的His 标签相比，这种结合的亲和力较弱。因此，大部分His 标记蛋白质取代了具有天然或偶然表面基序的蛋白质。不过，也有一些蛋白质的局部螯合氨基酸(如组氨酸)密度较髙，以至于几乎不可避免地会与固定化金属离子结合。一 般来说，哺乳动物系统含有天然连续组氨酸的丰度比细菌系统高(Crowe etaL, 1994)。人体细胞的转录因子 TFIIA的《亚基是一个非常重要的例子, 它有7 个连续的暴露在表面的组氨酸残基，可以是天然来源并以天然条件利用IM AC纯化（DeJong and Roeder, 1993; Ma et al.，1993)。使用抗His 标签抗体进行Western Blot检测，通常可以检测到TFIIA的 55 kDa(αβ前体) 或35 kDa(a 亚基）。另外一个例子是带有11个连续组氨酸的人类转录因子YYKShi etal.，1991)。在大肠杆菌中观察到可以与His 标记目标蛋白质共同纯化的蛋白质可分为4 组:①带有天然金属结合基序的蛋白质;②表面带有组氨酸簇的蛋白质；
③与异源表达的His标记蛋白质结合的蛋白质，如通过分子伴侣结合的蛋白质;④与琼脂糖载体具有亲和力的蛋白质(Bolanos-Garcia and Davies,2006)。大肠杆菌蛋白质中的某一个蛋白质是否会被共纯化是不易预测的。例如,21 kDa的 SlyD蛋白经常被报道会在使 用 Ni-N T A 时共同纯化。它是属于组②的一个蛋白质。但在我们实验室，在使用大肠杆 菌 BL21(DE3)、DH5a、M15(PREP4)和其他菌株的纯化过程中，从未观察到这个蛋白质。这也许是因为，这些杂质中多数是应激反应蛋白，培养条件和菌株状态都对其含量有影响，结果表现为目标蛋白质制备时样本污染。因此建议在大肠杆菌培养过程中尽可能降低应力(如通过使用无挡板摇瓶）。此外，一些共纯化蛋白质似乎更倾向于与C o结合，而不是Ni(或其他离子），而有些则相反。

一些消除共纯化蛋白质或在早期预防共纯化蛋白质吸附的方法已经得到评价, 部分方法将在下面章节中讨论。这些方法包括:①采取其他的纯化步骤;②调整His标记蛋白质与树脂的比例;③使用不表达该蛋白质的工程宿主菌;④使用替代的载体;⑤切割标签后使用反向色谱技术。

可以附加合适的纯化步骤，包括经典的色谱技术，如离子交换层析(IEX)和体积排阻色谱(SEC)。 IEX分离能力更高，而 SEC不仅可以按分子的大小分离并去除超高分子质量的聚合物，也可以用于脱盐，为下一步程序提供合适的条件。因此，类似于结构生物学中心这种高通量实验室, 需要进行蛋白质结晶或NMR质谱时，通常将附加的SEC作为标准化程序（Acton et al.， 2005; GrSslund et al.， 2008)。 虽然 IMAC-SEC (与 IMACIEX对应)作为标准化程序, 不必考虑蛋白质的化学特性(如pi) ，但是一根SEC色谱柱的分离范围并不适用于所有的分离目的，因此也许需要具有一系列的SEC柱 。 IEX和 SEC应用还有另一个问题，即为了充分利用这些技术，需要类似于自动化层析系统这样的昂贵设备，而这些设备通常不具备多并行程序，因而会导致低通量。 IMAC亲和纯化通常采用结合-洗涤-洗脱程序，可以以台式/重力流的模式进行。通过将另一种亲和标签(如Strep II、GST或 Flag)引人表达结构，可以两步纯化获得高纯度的蛋白质制剂，可以通过台式两步亲和层析程序完成（ Cass et al.， 2005; Prinz et al.， 2004)。

如前所述，调整回收His标记蛋白质的量以适应IMAC 树脂的结合能力，可以避免与 IMAC 树脂具有亲和能力的蛋白质共纯化，有助于提高蛋白质纯度。然而，蛋白质的His标记蛋白质的量通常是未知的，除非通过预实验估计目标蛋白质的含量。除此之外，更好的选择也许是使用敲除相关基因的工程菌表达目标蛋白质，以去除这些共纯化蛋白质 。然而据我们所知, 还未见到相关报道，而且利用基因敲除菌株生产蛋白质的经验还非常少。据报道，大肠杆菌菌株在缺乏1 7 种会与 IMAC树脂结合的蛋白质时仍可用于生产 ，其中包括一些重要的功能蛋白质，如超氧化物歧化酶和铁摄人调控子 (Bolanos-Garciaand Davies，2006)，并且这种菌株在应激条件下，如蛋白质过表达时仍然是可用于生产。但是这似乎也并不现实。

有报道采用一种不同的方法改进IM AC回收蛋白质的纯度，即对琼脂糖载体进行葡聚糖包裹。这种构建的层析载体已经广泛使用(Sepharoses、Superflow、Agaroses)，可以防止蛋白质通过结合介质发生共纯化(Mateo etal.，2001)。然而葡聚糖包埋珠不容易形成商品化IMAC树脂，并且这种方法仅可以排除与琼脂糖有亲和作用的蛋白质，却不能排除与固定化金属离子或目标蛋白质结合的杂质。硅 胶 IM AC载体也可以防止蛋白质与琼脂糖的亲和吸附，并且具有良好的压力稳定性，使其适用于髙分辨率HPLC。但通常硅胶树脂结合能力低，且对高pH 消毒程序耐受能力有限。最近，一种称为亲和沉淀的方法（ Hilbrig and Freitag, 2003)，避免了使用固相色谱载体，并已应用于IMAC(Matias-sonetal.，2007)。这种方法是将IMAC配基与一种活性聚合物进行化学偶联，当 与 His标记蛋白质结合，一 旦 pH 或温度等环境条件发生变化, 这种聚合物即可凝集并可通过离心分离沉淀。该应用程序仍较为复杂，但是一旦形成简单耐用的商业化材料，那么这种方法就可能会在 IMAC应用中发挥重要作用。使用溶液形式的配基, 可以克服His标记蛋白质与固定化配基间的空间位阻，以及微孔色谱介质对物质运输的限制。而且，这符合生产规模层析使用一次性材料的趋势要求。

最近还报道了另一种方法, 可用于无细胞表达后裂解液的蛋白质分离（ Kim et al.,2006)。 在加人模板和蛋白质表达前，将大肠杆菌裂解液与Ni-NTA亲和琼脂糖磁珠预罗浮育，可以去除与Ni-NTA有亲和力的蛋白质。文献结果显示S3 0 提取物的表达能力保持不变，并且比未经预处理相比，该方法Ni-NTA 纯化的His标记蛋白质组分的纯度较高。

虽然上述预处理策略可以提高M AC 蛋白质纯度，并且已证实在多数情况下均有用，但也不是普遍适用。然而, 有一种方法几乎适用于所有提髙纯度的要求，即用His标记蛋白酶切割His标签后进行反相IMAC层析，该方法的另外一个优点是可以保持天然或近似天然的蛋白质结构(Block e ta L ，2〇08)。这一策略克服了共纯化问题。在相同或相似的条件下用蛋白酶对蛋白质进行水解，加样于相同层析柱，与 IMAC树脂结合的蛋白质，如第一步纯化中的杂质，会再次结合于同一树脂，而裂解的无标签目标蛋白质收集在流穿组分中[反相IMAC或负相IMACXSubtractiv^ IMAC)]。可以用自身带有(不可裂解的）H is标签的外源或内源蛋白酶进行水解(Nilsson et al.，1997; Polayes et al.，2008)。用外源蛋白酶处理方法的优点在于速率更快，能形成无载体来源氨基酸的天然结构蛋白质(Arnau et al.，2006; Block et al.， 2008; Pedersen et al.，1999)。这种方法尤其适合蛋白质结晶或生物制药等类似的下游应用。值得注意的是，该方法只要求单一层析柱即可达到非常高的纯度。如图 27. 6 所示，将肿瘤坏死因子以IMAC—步纯化获得的形式(A 、B、C、D)结晶，或以上述反相IMAC获得的形式(A 、E、F、G)结晶。虽 然 SDS PAGE和考马斯亮蓝染色显示，Ni-N T A 纯化的His标记肿瘤坏死因子(TNFa)纯度很高(图27. 6A , 泳
道 IMAC)，但二维凝胶银染分析可见杂质（图 27. 6B)。通过反相IMAC去除杂质，得到极髙纯度的蛋白质制剂（图 27. 6E)。而且，图 27. 6 显 示 H is标签影响蛋白质结晶。在SEC层析中，有标签的和成熟的天然结构肿瘤坏死因子均可以以三聚体形式洗脱(图 27. 6C、F)，但需要在极其不同的条件下结晶，因此得到的晶体形式也不同（Hiss-TNFa: 四方形，图 27. 6 D;TNFa: 菱形，图 27. 6 G)。但是，每种形式计算分析得到的结构均与 Pdb数据库中同一形式的结构一致(数据未显示）。然而，当我们试图以相同的实验流程处理His标记白介素EB(IL-IB)和天然成熟状态IL-I 时， His标记的细胞因子却无法结晶(Block etal.，2008; 数据未提供)。我们的数据证实了其他一些研究者观察到的带有标签蛋白质的结晶现象，也提示设计表达形式时，提供切割标签的方法是有意义的。

6. IMAC应用于工业规模的蛋白质生产

考虑到His标签潜在的免疫原性及IMAC介质浸出的镍会导致过敏，直到最近才将IMAC用于工业规模制备蛋白质，如生物制药。然而，四价配位IM AC纯化得到的蛋白质制剂中检测到的镍浓度是比较低的，并且生物制剂的预期每日剂量中镍含量远远低于标准的每日镍摄入量和身体长期累积负荷(Block etal.，2008)。 H is标记蛋白质已经成功用于预防接种(Kaslow and Shiloach, 1994; Stowers et al.，2001) 或商品化药物(未出版）。此外，用蛋白酶去除重组蛋白中的人工序列，并将其用于人类，已经在上述内容中讨论。 IMAC是容易将柱床体积从毫升到升线性放大的层析方法(：Block et al,2008; Hochuli et al.，1988; Kaslow and Shiloach, 1994; ScMfer et al.，2000)，而且生物制药生产过程中，Ni-NTA Superflow层析柱的体积可以达到50 L(F. Schafer, 私人交流）。 IMAC介质的化学兼容性范围很宽，如高离液剂、盐、有机溶剂和表面活性剂(表27. 2)，可以改变其范围以适应每个蛋白质生产的特殊需要。例如，层析过程中加入表面活性剂(TritonX-114,Block et al.，2008)或有机溶剂（60% 异丙醇， Franken et al.，2000)等一些试剂，进行清洗，可以去除蛋白质产物中的细菌内毒素 (脂多糖)。已经证明IMAC在工业生产中的适用性，可以预计，因其耐用并且很少需要进行个体条件优化，将来应用会越来越广泛。

7. IMAC的高通量自动化

IM A C工艺耐用、普遍适用且应用广泛，因此也是蛋白质表达和溶解度并行筛选的理想工具。主要是以简 易 的 96孔形式进行，将琼脂糖IM A C树脂或磁珠IM A C树脂置于SBSfootprint filter、96 孔磁性微孔板或板式离心机上（ Braun et al.， 2002; Biissowet al.，2000)。 由于表达完整，并 且 IM A C纯化的结合-清洗-洗脱流程很容易微型化形成微孔板形式，因此也适合自动化液体处理实验室自动设备(见综述,L esley， 2001)。 自动化程序包括工作流程的不同部分，范围较广，可以是部分流程自动化，如手工制备大肠杆菌裂解液(Lanio et al.， 2000)、大肠杆菌或昆虫细胞裂解、裂解液澄清、蛋白质纯化(Garzia e ta l.， 2003; S c h a fe re ta l.， 2002b; Scheich e ta l.， 2003); 也可以实现从克隆构建到蛋白质分析的全部流程自动化(A cton e ta l.， 2005; H u n t， 2005; Koehn and H u n t， 2009)。最近，我们增添一系列的规程和耗材可供选择，均针对大肠杆菌、真核细胞或无细胞裂解液 的 H is标签蛋白质纯化: 理论上, 新实验室自动化设备可以从各种各样的样本中分离微克至毫克级别蛋白质(随机进样选项），现成的预充式样品盒提供酶、缓冲液和Ni-NTA磁珠用于裂解和纯化。图 27. 7 描述了使用一组构建体，对 24个序列进行优化，以筛选适合于人类蛋白质生产的表达纯化形式。天然条件下可以获得1. 4〜35 m g的高纯度蛋白质。无法在天然条件下纯化的蛋白质可以在变性条件下进行。用 抗 His-抗体进行Western Blot 分析，可以证明无孔间交叉污染存在 (数据未提供）。 这种高通量纯化实验获得的蛋白质，可用于功能分析(如相互作用研究）、随机突变蛋白质的特性分析、溶解度分析和克隆筛选。

通常表达筛选的下一步，是将少量蛋白质或克隆规模放大至毫克级产量，用于动物免疫、结构研究或药代动力学研究。单一蛋白质可以使用标准A k T A 或 FPLC系统来纯化。已开发的A K T A 系统（AkTAxpress)可以略增加纯化通量。具备较髙通量、低复杂度、也更利于一步（主 要 为 IMAC)亲和纯化（Steenetal.，2006; Str& nbergetal.，2005) 的设备已有报道，该系统正用于如人类蛋白质图谱计划等高通量项目中（Hoberand Uhlen, 2008)

8. 特殊应用： 膜蛋白纯化

在过去的几年中，由于膜蛋白作为药物靶点的巨大作用，因此在所有蛋白质种类中最受关注。事 实 上 ，目 前 商 业 化 药 物 以 及 研 发 靶 标 中 5 0 % 以上 是 膜 蛋 白（Drews,2000)。而且膜蛋白几乎占人类蛋白质组的3 0 % 。但与可溶性蛋白质相比，很少有人熟悉膜蛋白生物学和结构特征, 公共数据库中膜蛋白结构的代表性不足就反映了这一现象，如 P b d 不 足 1 % 。结构测定仍是难题。但是最近, 随着新表面活性剂的开发和相应的最适合复溶和纯化的表面活性剂的筛选，用标准化的 I M A C 程序进行膜蛋白的纯化已经日显简单（Eshaghi etal.，2005; K l a m m t etal.，2005; Lewinson etal.，2008) 。 通过对超过1 0 种细菌和人类来源的膜蛋白的检测，以 M A C 的兼容性、复溶效果和 NiN T A 纯化效率作为依据，筛选了超过5 0 种常用的表面活性剂，最终筛选到7 种有效表

表 27. 2 中列出了与IM AC 兼容的表面活性剂，但可能并不完整。其中包括具有良好复溶性的表面活性剂。在与某种表面活性剂联合使用时，H is标记膜蛋白与IMAC树脂似乎无法结合。这些现象取决于蛋白质-表面活性剂的结合体，似乎表面活性剂微粒包裹在蛋白质颗粒周围，部分或完全隐藏了 His标签。普遍使用的较长标签序列，如 H1。标签 ，似乎可以克服这种膜蛋白回收率的限制并且提高 IMAC树脂的亲和性(Byrne andJormakka, 2006； Grisshammer and Tucker, 1997； Mohanty and Wiener, 2004； Rumbley et al.，1997)。

9. 特 殊 应 用 ： 辞指蛋白纯化

考虑到技术上的需要，将在下文中介绍另一个大蛋白质超级家族是含有锌指结构的蛋白质组。仅 C2 H2 锌 指转录因子就已经超过 600 种，占人类蛋白质组的 2 % 以上(Knight and Shimeld，2001)。在这些蛋白质中, 每个指状结构均为两个半胱氨酸和两个组氨酸残基形成的空间构相与锌离子配位而成，单独一个多肽通常包含 4 个 或 5 个这样的基序。以类似的四价配位螯合金属离子的形式纯化金属蛋白质正是 IM AC纯化应用的最佳体现。

尽管四价配位的 IMAC配基与金属离子相互作用强，但不能排除树脂中的金属离子梓会与锌指中的锌离子发生交换。镍 是 IMAC蛋白质纯化中最常用的金属离子, 具有与锌颇为相似的理化性质，因此在这样的金属结合基序中很容易替代锌。而且通常 I MAC树脂中韓含量 (约 15 mmol/L) 远远高于His标记目标蛋白质的浓度 (umol/L 范围）。为了分析介质和金属蛋白质间可能发生的金属离子交换，我们在大肠杆菌中表达 His6 标记C2 H2 锌指转录因子 Y Y 1，并同时使用 Ni-N TA 和 Zn-N TA纯化。 NHMAC 和 Zn-MAC都可获得高纯度 Y Y l(图27. 9A , 泳道 E)。

ICP-MS(intercoupled plasma mass spectrometry) 常用于定量分析生物系统中的痕量金属元素，用该方法测定两种方式制备的 Y Y l 中的镍含量和锌含量 (Shi and Chance,2008)。 Z n - I M A C 纯化的蛋白质制剂中含有35. 6 mmol/L , 相 当 于 每 个 Y Y l 多 肽 约 有 6
个 Zn2+ ，而 Ni2+ 可以归结为缓冲液来源的痕量残余 ( 图 27. 9B ，右）。 然而 ， N i - I M A C 回收的蛋白质含有超过 25 m m o l / L Ni2+ 和 14. 2 mmol/L Zn²⁺C 图 27. 9 B ，左），相当于每个Y Y l 多肽离子约有 6 个金属离子( M e ²⁺ )

M e ²⁺与 多 肤 的 摩 尔 比 为 6 , 高 于 数 据 库 报 道 的 Y Y l 中 的 四 锌 指 结 构（http://W W W . uniprot org/uniprot/P25490)，某种程度上可以解释为与额外的金属离子在蛋白质的其他部位结合。图 27. 9B 中的数据提示，对 于 Y Y 1，带电荷的 IM AC配基和锌指间存在着明显的金属离子交换。如果采用金属离子亲和纯化 C2 H2 锌指基序，就需要选择带有锌离子的 IMAC配基，进而获得完整且均质的锌指组分。

1 0. 蛋白质纯化方案

本节中将简要介绍标准的IMAC 操作规程。优化的四价配位树脂 (如 Ni-NTA) 操作程序也同样适用于三价配位的树脂 (IDA-based)。 TED 树脂使用不同，下面将附生产商推荐程序 (如在咪唑浓度极低的条件下洗脱蛋白质, 相应地清洗缓冲液中咪唑也应保持低浓度)。

这部分将提供 Ni-NTA 琼脂糖树脂(Superflow, Agarose) 的纯化、清洗和再生的相关建议。 Ni-NTA 手册 (QIAGEN 公司，2003) 中已经详细描述了相关内容，这部分可以看成是该内容的更新。下面提供的缓冲液会根据个别蛋白质的需求补充 (如创造还原条件 、用甘油稳定蛋白质或提供辅助因子)。

天然条件下纯化His标记蛋白质

(1) 用基础缓冲液 NPI -10(50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/LNaCl、10 mmol/L 咪唑 ， pH 8. 0) 加人适合的裂解试剂裂解细胞。

大肠杆菌裂解时，建议使用终浓度 I mg/m L 的标准的蛋清溶菌酶, 该裂解形式非常有效 (如果细胞已冻结）, 且溶菌酶价格低廉。非常确定的是，溶菌酶可以从 IM AC树脂中清洗下来，不会存在于洗脱组分中（图 27. 5A 、图 27. 6A 和图27. 8;Block et aL, 2008)。另一种合适的方法是使用表面活性剂 [如 1 % ( V/V)CHAPS 或专用溶液] 或物理处理 (超
声 、高压/降压匀浆)。昆虫或哺乳动物细胞来源的培养物，推 荐 用 1 % IGEPAL CA-630(原 名 称 NP-40)。添加核酸酶有益于降低裂解液的黏度，已 证 明 Benzonase 核酸酶(3 unit/mL 细菌培养物) 既耐用又可以在IM AC树脂的清洗步骤中去除，并且可以通过商品化的 ELISA 进行检测(Block et al，2008)。冰上孵育裂解 30 min。

(2) 2〜8°C ，大于等于 10 000 g 条件下离心 30 min 澄清裂解，收集上清液。

(3) 用 5 个柱床体积 (bv) 的 NPI -10 平衡树脂后，将澄清裂解液上样，流速约 I mL/min(1mL b v 的层析柱），或不限速流过 (应用重力流速)。

结合时，适宜的线性流速为 155 cm/h，相当于一个直径约 7 mm 的柱流速为 I mL/minCl mL HisTrap和Ni-NTA Superflow Cartridges)。如果适用于流程操作方式，推荐采用直接混合，对于琼脂糖树脂，一般情况下这是最有效的模式，因此可以将所需体积的裂解液加至平衡后树脂，并 在 2〜8°C 旋转的孵育 I h。

⑷ 用 10 b v 的清洗缓冲液 NPI -20 清 洗 Ni-N T A 层析柱（50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl、20 mmol/L 咪唑， pH 8. 0)。
如已采用直接混合的形式, 可将结合后悬浊液倒入流速合适的层析柱。

(5)用 5 b v 的洗脱缓冲液 NPI -500 洗 脱 H is标记蛋白质（50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl、500 mmol/L 咪唑，pH 8. 0)。

在变性条件下纯化带有 His标签的蛋白质

(1) 裂解细胞使用基础缓冲液 B (K)O mmol/L NaH2PO4UO mmol/L Tris-HCl、8 mol/L 尿素， pH 8.0)。大肠杆菌以及大多数真核细胞可以被 7〜9 mol/L 尿素有效地裂解，但偶尔，带有 His标签的蛋白质形成包涵体不能完全溶解，在这种情况下，建议用盐酸胍取代离液剂尿素(缓冲液 A : 100 mmol/L NaH2PO4、10 mmol/L Tris-HCl、6 mol/L
盐酸胍， pH 8. 0)。为降低裂解液黏度，在变性条件下添加 Benzonase (3 units/m L 终浓度)也可能是有效的，但此时最大的尿素浓度为 7 mol/L (盐酸胍与 Benzonase 不能联合使用）。裂解物在环境温度下孵育 30 min。

(2) 在室温下，大于等于 10 〇〇〇 g 的条件下离心 30 min 进行裂解液澄清，收集上清液。

(3) 用缓冲液 B(或缓冲液 A ) 对树脂进行 5 个柱床体积 (bv)的平衡，随后将澄清的裂解液上样，流穿流速大约为I mL/mindmL b v 的层析柱)或不限制流速 (应用重力流速）。结合时, 合适的线性流速为155 cm/h, 相当于一个直径约 7 mm 的柱床的体积，其流速为 I mL/min(l mL 的 HisTrap 或 Ni-NTA Superflcw Cartridges)。如果适用于于实际工作流程，建议在直接混合的模式下进行结合，因为以琼脂糖为基础的树脂在一般情况下这样是最有效的，对于这一点，将需要的树脂用量缓慢的添加到裂解液中，并 在 2〜8°C 进 行 I h 旋转式的孵育。

⑷ 对 Ni-NTA层 析 柱 用 10 b v 的 洗 涤 缓 冲 液 C 洗 涤 （50 mmol/L NaH2PO4、10 mmol/L Tris-HCl、8 mol/L 尿素，pH 6. 3)。

如果已用直接混合法进行结合，在洗涤步骤之前，将结合的悬浊液倒入一个流量合适的层析柱。

如果是用缓冲液 A 处理产生的裂解液，洗涤和洗脱步骤可以转换缓冲液，使用尿素缓冲液或继续使用盐酸胍缓冲液，按照需要调整 PH。

(5) 用 5 bv 的洗脱缓冲液 E(100 mmol,’L NaH2PO4、10 mmol/L Tris-HCl、8 mol/L尿素，pH 4. 5) 洗脱带有 His标签蛋白质。

1 1 .清洗和消毒

对于以 Ni-N T A 为介质的 M A C 树脂，在从「标准」样品, 如大肠杆菌、人体细胞裂解物
或上清液中纯化蛋白质的过程中，简单而有效的在位清洗 (CIP) 方法是将树脂与〇.5 mol/L N a O H 接 触 30 min(Schafer et al.，2〇00)。 树 脂 已 在 高 达 I mol/L NaOH 中储存数个月 ，证明树脂在不降低效能的同时甚至可以承受大于 100 个循环的纯化/ C IP 周期 (数据未提供)。非常确定的是，这 种 Ci p 程序可以在纯化过程中使上样样品中非特异吸附于琼脂糖上的蛋白质发生变性和解吸附，一般也可用于消毒（去热原、病 毒 、清除微生物；Levison etal.， 1995)。如果上样的样品是「不寻常的」，如富含脂质的裂解液，则需要调整清洗程序。酸 、碱及其他试剂都可以用于清洗，包括乙醇 (100% ) 、异丙醇 (30% ，V7V )、SDS(2% ，to/V )、乙酸(〇 .2 mol/L)、氢氧化納 (I mol/L)或表面活性剂(表27.2)。

对于反复再利用的 Ni-N T A 柱 ，我们建议再平衡后采用上述的 C IP 程序处理。需要长期储存 (几年)的树脂可保存在 3 0 % (V/V) 乙醇中，或如果想选择非易燃试剂，那么可以 在 0 •01〜0.1 mol/L 氢氧化钠中存储。也可以在 1〇 mm 〇 i/L NaN3 中储存。即使在多次重复使用或长期存放之后，通常也不需要剥离或者再负荷金属离子。

1 2. 简化的金属离子剥离和再负荷方法

但是 ，当 N i-N TA 树脂已严重损坏或随着结合能力日益下降时，如反复加载富含脂质或含有螯合成分的样品，可以很容易将镍或其他金属离子剥离或再负荷。从 第 3 步开始 ，这种简化的规程也适用于最初购买的未负荷金属离子的N T A 树脂。

(1) 用 10 b v 的去离子水 (dH20 ) 将树脂清洗干净 (见上文） 。

(2) 5 bv pH 8. 0 100 mmol/L ED TA 加载于树脂柱床, 剥离金属离子。

⑶ 用 10 W d H 2O 清洗树脂。

⑷ 2 bv 100 mmol/L 金属离子溶液加载至树脂柱床 (如 NiSO4 和 NiCl2)。

其他成功稳定固定化的金属离子, 包括铜 （CuCl2、CuSO4)、锌 （ZnCl2、ZnSO4)、钴(CoCl2、CoSO4)和铁 [FeCl3、Fe2 (S04) 3]。

(5) 用 10 bv dH 2O 清洗树脂，去除所有未结合的金属离子。

(6) 加入存储缓冲液或用至少 5 b v 的起始缓冲液平衡柱立即使用化效率未受影响。 R T 的活性也未受影响，而且反应终点 （图 27. 5B)和实时定量 RT-PCR