材料与仪器
酵母菌株
消解酶 100T
毛细吸管头 强力胶水 光学玻璃纤维 YPD平板 YPD培养管
消解酶 100T
毛细吸管头 强力胶水 光学玻璃纤维 YPD平板 YPD培养管
步骤
第 1 天
显微针的制备四分体解剖针可以通过手工拉制细玻璃丝或使用「技术和方案 23, 制备四分体解剖针」中描述的光学纤维玻璃丝来制备。将会演示针的准备过程并且提供给你一些必需品，以便你可以自己制备。针和固定器也可通过商业途径获得。
用消解酶处理在开始本课程前 3 天，指导教师会把二倍体菌株 3-3 接到孢子形成培养基上。在显微镜下观察形成孢子的培养物，并辨别未形成孢子的细胞以及四孢子子囊，以及少于四个孢子的子囊。每个学生将安排 3 天时间用 4 个活的孢子来制备 20 个解剖了的四分体，并用消解酶的方法来处理细胞。在「技术和方案 22，四分体解剖」中描述了四分体的显微操作。
第 3 天
完成四分体的解剖。
第 5 天
每个学生必须用无菌扁平牙签和模板（附录 D，平板划线模板）制备两块上面有 4 个活孢子菌落（每块板有 10 个四分体）的母板。每个平板上包括两个亲本对照菌株。
在 30°C 下过夜培养。
第 6 天
影印平板上的四分体到测试培养基影印母板到以下培养基上：YPD、SC-leu、SC-arg、SC-ade、SC-trp、YPD+cyh 和 6 个以上的 YPD 平板（在开始前见下面的提示）。第一块 YPD 平板作为新鲜的母板留作后用。其余的 YPD 平板用于将孢子菌落与测试菌株的交配。所有平板在 30°C 下培养。
提示：从一块原平板做 12 次影印是一个大的工作量。在 6 次影印后，在影印模具上放一块新的绒垫，并用母板做新的影印。因为用了两次母板，第一次用绒垫要轻些影印，以便第二次影印时在原板上还保留有细胞。每次影印后要检查一下，应该能看到其相应于母板上排列方式的轻微的细胞沉淀。如果没有看到，要再试一次。另一种方法:
孢子菌落接种到含有无菌水的一个微量滴定盘中，然后用多头接种器，即多头转接技术 (froggingtechnique) 将这些细胞转移到不同测试板上。在^J 和的菌株间能发生交叉给养（cross-feeding), 因此轻微地影印到 SC-trp 板上是重要的。
交配型和等位基因测试菌的准备在 5 ml 的 YPD 培养基中培养测试菌株 3-4 到 3-13。或者，在 YPD 培养基上制备大块的测试菌株的菌斑。30°C 下过夜培养。
第 7 天
交配型测试菌苔的准备使用其中一种方法。
a. 离心 5 ml 的 3-4 和 3-5 菌株培养物（桌面离心机 2000r/min，5 min)。在一个无菌的旋盖试管中用 4 mlYPD 重悬浮菌体。加 0.15 ml 无菌水和 0.15 ml 重悬的菌株 3-4 的培养物到两块 SD 平板（剩余细胞储备在 4°C)。用无菌棒将菌体涂匀，水平放置平板，使平板晾干。同样处理菌株 3-5。
b. 用收集棒从 YPD 平板上刮取菌株 3-4 的一个新鲜菌斑，重悬于 4 ml 的 YPD 液体培养基中。过夜培养使之细胞浓度达到过饱和。涂 0.2 ml 菌液到两块 SD 平板上。同样处理菌株 3-5。液体挥干后，影印平板到菌苔上。
等位基因和互补测试菌苔的准备除 MATa 和 MATa 型测试菌株被置于同一块平板外，这些菌苔的准备与在「交配型菌苔」中的方法同样。准备 4 种类型的测试菌苔，并且每种准备两块。在 SC-ura-his 平板上涂开 arg4 测试菌苔（菌株 3-6 与 3-7 混合，菌株 3-8 与 3-9 混合）。对于 Trp 互补菌苔（菌株 3-10 与 3-11 混合，菌株 3-12 与 3-13 混合），将细胞涂到 SC-trp 平板上。在影印平板到菌苔上以前，让液体变干。
复制平板到测试菌苔用 6 个前一天制备的四分体的 YPD 影印物作源影印到 6 个测试菌苔上。对于每个测试菌苔，均用一个新的绒垫，把 YPD 平板印在绒垫上，然后将测试菌苔平板印在绒垫上，以此来转移四分体到测试菌苔上。测试平板在 30°C 下培养过夜。
第 9 天
影印 SC-um-his 平板上的等位基因测试菌苔到 SC-arg 平板上并且冷藏。在当日结束时，由实验室助理收集平板，用 STRATAGENE 公司的 Stmtalmker7500|uJ 的紫外线灯（254nm) 照射。
分析交配型测试平板和 Trp 互补平板的生长情况。由于 tr 和缺陷菌株能与缺陷菌株共生，需要影印 SC-trp 平板到一块新的 SC-trp 平板上并在第二天分析。
第 10/11 天
分析 arg4 等位基因测试平板及 Trp 互补平板。
第 11 天
确定在杂交中每种对标记发生分离后的 PD、NPD 和 T 型四分体的数量。在本实验末尾的记录单上记录 PD/NPD/T 型资料。此外，记录每个标记的第二次分裂分离的频率。通过搜寻在酵母基因组数据库（SGD;http://www.pathway,yeastgenome.org/) 中的关于每个基因图谱的信息来确定每个基因与着丝粒间的距离。用收集的资料计算：
1) 每个分析基因与所有其他分析基因间的图谱距离 2) 每个基因与它的着丝粒间距离（如何与 SGD 提供的信息相比较?）3) 所有我们研究的等位基因的基因转换频率（3:1 或 1:3 分离）第 14 天准备提交资料
显微针的制备四分体解剖针可以通过手工拉制细玻璃丝或使用「技术和方案 23, 制备四分体解剖针」中描述的光学纤维玻璃丝来制备。将会演示针的准备过程并且提供给你一些必需品，以便你可以自己制备。针和固定器也可通过商业途径获得。
用消解酶处理在开始本课程前 3 天，指导教师会把二倍体菌株 3-3 接到孢子形成培养基上。在显微镜下观察形成孢子的培养物，并辨别未形成孢子的细胞以及四孢子子囊，以及少于四个孢子的子囊。每个学生将安排 3 天时间用 4 个活的孢子来制备 20 个解剖了的四分体，并用消解酶的方法来处理细胞。在「技术和方案 22，四分体解剖」中描述了四分体的显微操作。
第 3 天
完成四分体的解剖。
第 5 天
每个学生必须用无菌扁平牙签和模板（附录 D，平板划线模板）制备两块上面有 4 个活孢子菌落（每块板有 10 个四分体）的母板。每个平板上包括两个亲本对照菌株。
在 30°C 下过夜培养。
第 6 天
影印平板上的四分体到测试培养基影印母板到以下培养基上：YPD、SC-leu、SC-arg、SC-ade、SC-trp、YPD+cyh 和 6 个以上的 YPD 平板（在开始前见下面的提示）。第一块 YPD 平板作为新鲜的母板留作后用。其余的 YPD 平板用于将孢子菌落与测试菌株的交配。所有平板在 30°C 下培养。
提示：从一块原平板做 12 次影印是一个大的工作量。在 6 次影印后，在影印模具上放一块新的绒垫，并用母板做新的影印。因为用了两次母板，第一次用绒垫要轻些影印，以便第二次影印时在原板上还保留有细胞。每次影印后要检查一下，应该能看到其相应于母板上排列方式的轻微的细胞沉淀。如果没有看到，要再试一次。另一种方法:
孢子菌落接种到含有无菌水的一个微量滴定盘中，然后用多头接种器，即多头转接技术 (froggingtechnique) 将这些细胞转移到不同测试板上。在^J 和的菌株间能发生交叉给养（cross-feeding), 因此轻微地影印到 SC-trp 板上是重要的。
交配型和等位基因测试菌的准备在 5 ml 的 YPD 培养基中培养测试菌株 3-4 到 3-13。或者，在 YPD 培养基上制备大块的测试菌株的菌斑。30°C 下过夜培养。
第 7 天
交配型测试菌苔的准备使用其中一种方法。
a. 离心 5 ml 的 3-4 和 3-5 菌株培养物（桌面离心机 2000r/min，5 min)。在一个无菌的旋盖试管中用 4 mlYPD 重悬浮菌体。加 0.15 ml 无菌水和 0.15 ml 重悬的菌株 3-4 的培养物到两块 SD 平板（剩余细胞储备在 4°C)。用无菌棒将菌体涂匀，水平放置平板，使平板晾干。同样处理菌株 3-5。
b. 用收集棒从 YPD 平板上刮取菌株 3-4 的一个新鲜菌斑，重悬于 4 ml 的 YPD 液体培养基中。过夜培养使之细胞浓度达到过饱和。涂 0.2 ml 菌液到两块 SD 平板上。同样处理菌株 3-5。液体挥干后，影印平板到菌苔上。
等位基因和互补测试菌苔的准备除 MATa 和 MATa 型测试菌株被置于同一块平板外，这些菌苔的准备与在「交配型菌苔」中的方法同样。准备 4 种类型的测试菌苔，并且每种准备两块。在 SC-ura-his 平板上涂开 arg4 测试菌苔（菌株 3-6 与 3-7 混合，菌株 3-8 与 3-9 混合）。对于 Trp 互补菌苔（菌株 3-10 与 3-11 混合，菌株 3-12 与 3-13 混合），将细胞涂到 SC-trp 平板上。在影印平板到菌苔上以前，让液体变干。
复制平板到测试菌苔用 6 个前一天制备的四分体的 YPD 影印物作源影印到 6 个测试菌苔上。对于每个测试菌苔，均用一个新的绒垫，把 YPD 平板印在绒垫上，然后将测试菌苔平板印在绒垫上，以此来转移四分体到测试菌苔上。测试平板在 30°C 下培养过夜。
第 9 天
影印 SC-um-his 平板上的等位基因测试菌苔到 SC-arg 平板上并且冷藏。在当日结束时，由实验室助理收集平板，用 STRATAGENE 公司的 Stmtalmker7500|uJ 的紫外线灯（254nm) 照射。
分析交配型测试平板和 Trp 互补平板的生长情况。由于 tr 和缺陷菌株能与缺陷菌株共生，需要影印 SC-trp 平板到一块新的 SC-trp 平板上并在第二天分析。
第 10/11 天
分析 arg4 等位基因测试平板及 Trp 互补平板。
第 11 天
确定在杂交中每种对标记发生分离后的 PD、NPD 和 T 型四分体的数量。在本实验末尾的记录单上记录 PD/NPD/T 型资料。此外，记录每个标记的第二次分裂分离的频率。通过搜寻在酵母基因组数据库（SGD;http://www.pathway,yeastgenome.org/) 中的关于每个基因图谱的信息来确定每个基因与着丝粒间的距离。用收集的资料计算：
1) 每个分析基因与所有其他分析基因间的图谱距离 2) 每个基因与它的着丝粒间距离（如何与 SGD 提供的信息相比较?）3) 所有我们研究的等位基因的基因转换频率（3:1 或 1:3 分离）第 14 天准备提交资料
来源：丁香实验
