利用声孔效应将基因转移入胚胎

利用声孔效应将基因转移入胚胎

材料

试剂

乙 醇（7 0 % )

表 达 载 体 ，如 PEGFP (Clontech; 632319)，其 DNA浓 度 为 I .0〜2.0ug/ul

将 DNA溶 解 在 T E 溶 液（PH8. 0 )

鸡 受 精 卵

Hank 溶 液（l 〇 mmol/L HEPES， 140 mmol/L NaCl， 27 mmol/L K C l , 0.1%葡 萄 糖 ， 〇.34m m o l / L N a 2 HPO4C ， 0.5m m o l / L CaCl2 ， 〇.5m m o l / LMgCl2 ， pH^ 7 . 4 )

O P T I S O N : 微 气 泡 试 剂（A m e r s h a m H e a l t h 2707-03)

2〜8°C 冷藏。

氯 化 钠（N a C l ; 0. 9 % ) 或者鱗酸盐缓冲液（P B S )

T E 溶 液（10m m o l /L T ris——H C l ， l m m o l /L E D T A ， p H 为 8.0)

仪器

黑 墨 水（Pelikan)

慑 子（w a t c h m a k e r 的 5 号 直 镊 子）

从玻璃毛细管制备得到的玻璃显微针（C M ; Narishige)

预 先 设 定 微 38. 5°C 的孵箱

微量移液器

显微镜

培 养 皿（35m m )

剪 刀（直、精制）

Sonitron 1000N 或 者 Sonitron 2000N (R i c h M a e ， Inola， Ok l a h o m a 或 者 日 本 的Nepagene)

用 于 从 蛋 清 中 吸 取 受 精 卵 的 注 射 器（5m l ) 和 1 8 计 量 注 射 针
用 于 注 射 墨 水 的 注 射 器（Iml) 和 2 6 计 量 注 射 针

0.5m l 的管

乙 烯 树 脂 带

方法

制备 DNA-微气泡混合物

1.取 5〜 IOul D N A 储 存 液（如 p E G F P I. 〇 〜2. Oug/pu) 置于 0 •5m l 管中。

2 . 在管中加入 10〜15ul 0 •9 % 的 N a C l 或者 P B S ( D N A 终浓度为〇.25〜I.Oug/ul)。

3 . 轻轻摇晃 O P T I S O N , 直到溶液均匀。在含 有 D N A 的管中加人 I0〜20ul 微气泡溶液。混合均匀并放在冰上。

该 DNA-微气泡混合物可用于注射 1 〇次。在制备后 2 h 内使用。

声孔效应

举例，用 于 HH20〜2 1 阶段鸡肢芽的基因转移。

4 . 在 38. 5°C 孵育鸡受精卵，直 至 HH 20〜2 1 阶段。

5•用 7 0 % 乙醇对卵冗进彳了消毒。在卵的圆头端制造一个小孔。吸取 4〜5m l 蛋清到装有18 计量注射针的 5m l 注射器中。

6•用精制的直剪去除卵壳，从而为后面的操作打开一个窗口。

7•用 Hank溶液约 10 倍稀释黑墨水。为了观察鸡胚，用 装 有 26 计量注射针的 Im l 注射器在囊胚层中注射 0 •05〜0 •Im l 稀释的黑墨水。

8 . 用 精 制 的 watchmaker 镊子去除鸡肢芽邻近的卵黄膜。如果需要，用 几 滴 Hank溶液。

9 . 用微量移液器均匀混合 DNA-微气泡混合液。在 35 mm 培养板上滴上 2〜3ul DNA-微气泡混合液。将 0.25〜0.5ul1DNA-微气泡混合液吸人玻璃显微针中。保证微气泡在DNA-微气泡混合液中。

10•将 DNA-微气泡混合液注射入肢芽间质（图 1C)。由于 DNA-微气泡混合液会从注射位点渗漏出去，可以根据靶器官调整注射方法。注射后，通过在亮视野显微镜下观察到白色（反射光引起的白色）确保注射部位存在微气泡。

11•将超声波仪的探针（3 mm 直径）轻轻地接触注射区域使注射的肢芽部位暴露于超声。所用参数为 2. OW/cm2 工作期 2 0 % ，以及 60s (图 1A ， B)。超声照射后，注射部位的白色消失。

12.超声暴露后，用乙烯树脂带覆盖窗口并孵育受精卵。

13•用 LacZ (图 2A ， B) 或者绿色荧光蛋白（GFP) (图 2C〜E ) 来观察鸡胚中声孔效应 DNA 表达的部位。