嗜菌体 ΦC31 整合酶介导的位点特异性整合实验

用细菌嗜菌体ΦC31 整合酶进行的位点特异性整合

材料

试剂

琼 脂 糖 和 上 样 缓 冲 液

细 胞 ：永 生 化 哺 乳 动 物 细 胞 系 或 原 代 细 胞

D N A 连 接 酶 和 合 适 的 连 接 缓 冲 液

D N e a s y T i s s u e K i t (Q I A G E N ) 或其他用来提取基因组 D N A

电转移用的大肠杆菌 D H l O B 感受态

胎牛血清

F u G E N E 6 转 染 试 剂（R o c h e ) 或同等试剂

G 4 1 8 或其他适当的选择药物

硫 酸 庆 大 霉 素（G I B C O ) 或 其 他 适 合 的 在 哺 乳 动 物 细 胞 中 进 行 选 择 的 药 物

培 养 基

高 葡 萄 糖 的 D M E M (Dulbecco’s modified Eagle’s m e d i u m )

含 选 择 性 抗 生 素 的 L B (Luria-Bertani) 琼 脂 板

含选择性抗生素的 L B 液体培养基

O p t i - M E M I 培 养 基（Invitrogen)

补充的 D M E M 培养基：高葡萄糖且添加了 9% F B S 和 1% 青霉素或链霉素

质粒

整合酶表达质粒， p C M V I n t (Groth etal.2 0 0 0) 和适合的控制质粒pCMV-mlnt (Olivares et al., 2002)
Φ
pCM Vm lnt 与 pCM VInt 的区别主要是在催化位点丝氨酸的突变致使其编码的产物Φc31 整合酶失活

含有一个物种和细胞类型感兴趣的待转移基因的适当的表达盒的质粒。

如果要用药物进行选择，应包括一个适当的哺乳动物抗性基因。

质粒包括最小（34bp ) 或 者 全 长（约 300bp ) a t t B 序歹 Ij (Groth et al.2000)p E G F P -C l 报道质粒

Qiafilter Plasmid M a x i Kit (Q I A G E N ) 或同等试剂盒

Q I A q u i c k Gel Extraction Kit (Q I A G E N ) 或同等试剂盒

P C R 寡核苷酸，如 表 1 所示

磷酸盐缓冲液（P B S )

限制性内切核酸酶和适当的缓冲液

膜岛素（0 . 0 5 % ) /E D T A (lmmol/L) (Invitrogen 或 同 等 试 剂）

仪器

离心机

电穿孔仪（Bio-Rad) 或其他细菌转化方法

流式细胞仪

血球计

孵育器，预设为 37℃

小离心管

组织培养板（6 孔 和 100 mm )

管（12X 75 Falcon)

方法

转化

1 . 构建含有位点和感兴趣的待转移基因的供体质粒，克隆ΦC31 整合酶似出序列到表达载体。注意整合效率与 a t t B 的位置和方向无显著相关。这一质粒构建步骤要求合适的酶和试剂，如含选择性抗生素的 L B 琼脂板和Q I A q u i c k GEL Extraction Kit。转化供体质粒到电转化感受态细胞 D H l O B 大肠杆菌接种到适量的 L B 培养基 。用 Qiafilter Plasmid M a x i K i t 可能得到足够纯度的 D N A 来进行后续的实验。

2.转染前 24 h ，用 0.05% 胰酶 1mmol/L EDTA 收获黏附哺乳动物细胞。用桌面离心机 1200r/min 离 心 I O min , 用适当体积的 PBS 重悬沉淀，用血球计数器进行计数。

在 6 孔板上铺 4 个孔，种子浓度为 30 % ，用适合此细胞类型的培养条件 37℃孵育过夜。

3.各 取 100ul O p t i - M E M I 加到 4 个小离心管中，每一个管中加 3ul 室温的 F u G E N E 6,温和混匀，室温孵育 5min 。

4.用以下方法在各管中加入 D N A :

管 1 : 无 D N A

管 2: I f x g p E G F P -C l 报道质粒

管 3: 900n g p C M V I n t 和 100 ng 转基因质粒

管 4: 900ng p C M V m i n t 和100 ng 转基因质粒

温和混勻室温孵育 25min 。

5 . 吸去每孔的培养基，每孔补 加 2m l D M E M 培养基。然后每孔分别逐滴加入100ul O p t i - M E M I 中的脂质体 D N A 复合体， 37℃ 脖育过夜。

6•转染 24 h 后 ，用流式细胞仪检测转染效率，操作如下：

a. 收 获 细 胞 从 无 D N A 和 lM g p E G F P -C l 孔 ，用 1ml 0.05% 胰酶 1 mmol/L的 E D T A 。

b. 用桌面离心机 1200r /m in ， 10 min 离心收集细胞。

c. 重悬沉淀到 200ul P B S ，转移到 12X 75 Falcon 管作流式细胞分析 G F P 的表达情况。

一般情况下，转染效率超过 15 % 已经足够了。为了建立稳定转染，可进行以下可选择的操作。

7.胰蛋白酶作用和重新铺两个孔的细胞到 3 个100 m m 的培养皿中，并补加 D M E M 培养基，每一孔用 1/3 最初孔的体积接种 100mm培养皿，另外两个分别用 1/10和1/30。

铺板的梯度减少了转染效率对随着一段时间的选择辨别直接的耐药克隆的能力的影响。

8.铺板后 24 h , 吸掉培养基，补加含 1.25m g /m l G 418 (m/V) 的 D M E M ， 或其他合适的药物浓度。

9.每 4 天替换 1 次选择培养基，注意不要丢掉初生的克隆。

随后的 14d 药物选择中，应该能够容易地确认独特的克隆。

可供选择的方法

稳定转染群

紧接前面的步骤 6 , 用以下方法操作：

1.胰酶消化从两个孔得到的流式细胞检测后的细胞。用 桌 面 离 心 机 1200 r/min 离心10 m i n 收集细胞，重悬细胞沉淀到补充的 D M E N 培养基。

2.分别铺每孔的全部培养物到 100细胞培养板。使细胞像通常一样生长到一定的密度和传代。

3.传几代以后，用适当的方法检测转移基因的表达。最初用ΦC31 整合酶和转基因奴出质粒转染的细胞转移基因的表达应该比对照高 几 倍（Thyagarajan and Calos 2005)。