材料与仪器
步骤
MIGRS 在培养细胞中的使用
材料
试剂
培养细胞的相应培养液
二 甲 亚 砜 (DMSO， Sigma-Aldrich D8418)
乙 醇（80%)
Hank's 平 衡 盐 液（HBSS)
米 非 司 酮 （Mfp， RU-486; Sigma-Aldrich M8046)
M fp粉末装于棕色瓶， 4℃保存。为避免 M fp暴露于空气中而凝固，在称量之前可将MfP置于封闭容器中以平衡至室温。含 Mfp 的 溶 液 应尽量避光。用 DMS0 溶 解 M P 粉配置10-2mol/L 的储存液。储存液可在一2℃ 中 保存6个月 。用于细胞培养实验时，用 80% 乙醇稀释储存液至l0-2mol/L 作为工作液。工作液可在一20℃ 中 保 存 6 个 月 。将工作液加人细胞培养基使Mfp浓 度 为 l0-8mol/L 或 l0-7mol/L 。
M E M 加 入 谷 氨 酸 盐 、抗 生 素 、 10 % 胎 牛 血 清（FCS )
S F C S
细胞
适当的转染试剂
仪器
37℃ CO2细胞培养箱
方法
1. 将载体转染细胞。
质粒的转染
a. 主要根据转染试剂相应的操作手册进行转染。
在保证通过不同质粒将M IGRS与靶基因转染人细胞的前提下，可调整这些质粒的比例以控制基础表达与靶基因诱导表达的水平。对 于 G L V P开关蛋白来说， G LV P质粒与靶基因质粒摩尔比为1 : 10〜1 : 2. 5。对 于 GLp65 开关蛋白，两种质粒比例为1 : 1 时 ，可得到显著降低的基础表达。
强组成型启动子可引起较高基础表达，里开关蛋白与靶基因质粒比也较低。总之 ，这两种质粒比例的选择主要是经验性的，目的是得到理想的基础表达与靶基因诱导表达。
b. 转染后，立即用 HBSS 洗细胞，并在无M fp 培养基中孵育细胞至少3 h。
c. 用预温的含10-8mol/L Mfp、 5%〜1 0 % SFCS 细胞培养基换液。
重组病毒载体的转染
a. 根据病毒自身特点和感染细胞类型决定感染条件。
HSV载体、第一代腺病毒载体、 HI> Ad 载体已被分别用于 Vero、 HeLa 及 HePG2 细胞
b. 转染后，立即用HBSS洗细胞，以去除多余载体。
c. 将细胞转至正常培养基，使之恢复 3〜12 h。
d. 最后用含 l0-8 smol/LMfp、 5%〜1 0 % SFCS细胞培养基换液
2. 用含 Mfp培 养 基 育 细 胞 24〜72 h , 时间长短因不同细胞而异。
3 . 收集细胞，分析靶基因表达情况（ Yeet al.2002)。
通过电穿孔法和质粒注射的 M IG R S 体内应用
材料
试剂
小鼠
米非司酮 (M f p , R U -486; Sigma-Aldrich M 8046)
用于腹腔注射和灌胃时，用 芝 麻 油 将 10—2mol/L 的储存液稀释至 2X l0-4mol/L 。将此稀释好的注射液置于 4℃ 过 夜 ，以使之分层。注射前，将注射液置于室温避光处约 lh。该注射液 可 于 4℃ 保 存 3 周 ，而 M f p 活性不受影响。还可用能被生物降解的缓释颗粒包裹 M f p 用于 皮 下 接 种 ，可 实 现 M f p 稳 定 持 续 的 注 人 。 InnovativeResearchof America (Sarasota，Florida) 公司的技术支持可获得最好的实验效果。计算包裹于一个颗粒中的 M f p 量 时 ，可用 所 需 M f p 每 日 注 射 量（ug/kg) 乘 以 动 物 平 均 体 重（kg)，再 乘 以 M f p 给药天数。
质粒
质粒纯化试剂盒（大包装）
聚乙烯吡咯烷酮或盐水
芝 麻 油（Sigma-Aldrich S 3547)
仪器
带两个平行板卡钳电极的电穿孔仪（可选，见步骤 3)
方法
1.用质粒大包装纯化试剂盒（250 〜 500ug) 纯 化质粒，具 体操作参见试剂 盒 说 明书。
2.用 1mg/ml 聚乙烯吡咯烷酮或盐水重悬纯化好的质粒。
3, 将 25〜50ug DNA 分别注人麻醉小鼠两侧胫前肌或腓肠肌。
可在注射后用两个平行板卡钳电极行电穿孔和方波脉冲电转染，以提高肌肉转染效率。电穿孔的电压通常为在两个 25us 的方波脉冲下以 375V /cm 转染两次。
4.由于质粒注射后可有轻微的炎症反应，所以 注射或电穿孔后让动物恢复 4d。
5.根据动物体重计算 M f p 用量， 250〜300ug/kg , 用芝麻油稀释 M f p 至 2 X l0-4mol/L
通过腹腔注射或灌胃给药。
或 者 ，植 人 含 M f p 的可降解缓释微粒可获得持续诱导靶基因表达的效果。
6.给予特定剂量的 M f p 后 ，根据质粒或靶基因表达产物在细胞质中的半衰期来选择分析目的基因表达的时间。
如果不知道半衰期，在 M f p 给药后首先要测定目标基因表达的表观动力学。
病毒介导的基因转染
材料
试剂
米 非 司 酮 （M f p , R U -486; Sigma-Aldrich M 8046)
用于腹腔注射和灌胃时，按 方 案 1 用 芝 麻 油 将 10-2mol/L 的 储 存 液 稀 释 至 2 Xl0-4mol/L 。将 此 稀 释 好 的 注 射 液 置 于 过 夜 ，以使之分层。注射前，将注射液置于室温避光处约 lh,使之复温。该注射液可于 4℃ 保 存 3 周 ， M f p 活性不受影响。
啮 齿 动 物
芝 麻 油（Sgma-Aldrich S 3547)
仪器
定 位 装 置 或 用 于 尾 静 脉 注 射 的 针 头 、注 射 器（见 步 骤
方法
1.通过定位装置或系统尾静脉注射将编码 M I G R S 和靶基因盒的病毒载体注入动物体内(Oligino et al. ， 1998; Burcin et al.， 1999; Schillinger et al.， 2005)。
通过这两种给药方式给予大量病毒，都能够造成较高的基础表达。基础表达和诱导表达水平取决于多种因素，包括病毒液中病毒颗粒与 I U 的比例、被转染组织的特点及用于启动开关蛋白表达的启动子。合适的转染条件需要经过摸索，建议以所有病毒液作为初始剂量。
2.由于病毒载体注人后常伴局部炎症反应，因此注射后让动物恢复 1〜2 周
3.用芝麻油稀释 M f p 至 2X 10-4mol/L, 通过腹腔注射或灌胃给药。
4.选择恰当时间点对目的基因表达情况进行分析。
应通过血浆或细胞质中目的基因的半衰期来确定，如果不知道半衰期，则需摸索条件
转基因模型
材料
试剂
米 非 司 爾 （M f p ， R U -486; Sigma-Aldrich M 8046)
用于腹腔注射和灌胃时，按 方 案 1 用 芝 麻 油 将 K T 2mol/L 的 储 存 液稀释至 2 X I0-4mol/L 。将此稀释好的注射液置于 4℃ 过 夜 ，以使之分层。注射前，将注射液置于室温避光处约 lh，
使之复温。该注射液可于 4℃ 保 存 3 周 ， M fp 活性不受影响。通 过 皮 下 植 人 含 M f p 的缓释可降解颗粒可获得持续稳定的转染效果。 Innovative Research of America (Sarasota， Florida) 公司的技术支持可获得最好的实验效果。计算包裹于一个颗粒中的 Mfp 量 时 ， 可用所需 M f p 每 日 注 射 量（ug /kg) 乘 以 动 物 平 均 体 重（kg) , 再 乘 以 M f p 给药天数。
小 鼠
芝 麻 油（Sigma-Aldrich S3547)
仪器
N o r t h e r n 印 迹 或 定 量 反 转 录 P C R 相 应 设 备（见 步 骤 4) 。
方法
1. 首 先 创 建 第 一 转 基 因 基 础 鼠 系 。转 入 表 达 开 关 蛋 白 的 载 体 ，该 蛋 白 质 由 组 织 特 异 性启动子启动，保证了目的基因最后只能在特定组织中表达。
2 . 创建第二转基因基础鼠系。转入目的基因载体，其中目的基因受 H S V 胸苷激酶或腺病 毒 E l B T A T A 等最小启动子调控，并位于多拷贝 Gal4 U A S 之后。
3.激活靶基因表达（同方案 3 中将 M I G R S 用于基因治疗模型）。将 330ug/kg M f p 溶于 芝 麻 油 （2 X 10-4mol/L )，通过腹腔注射或灌胃给药。
可 将 含 M f p 的可降解缓释颗粒植人皮下，从而获得稳定长期的目的基因表达。
4.通过 Northern 印迹或反转录 PCR 分析各转基因基础鼠系中开关蛋白的表达特点。
通常 ，高水平的开关蛋白表达可获得高水平的目的基因最大诱导表达，但同时也造成较高的基础表达。
5 . 当明确了相应基因在两种基础鼠系中能恰当表达后，将两者杂交，从而 获 得 能同时表达开关蛋白和 M f p 诱导、组织特异性靶基因的双转基因鼠。
与对基因治疗模型的转染相似，转基因模型中目的基因的基础表达和诱导表达水平取决于特定组织中开关蛋白的表达量。而开关蛋白表达水平又受相应启动子、染色体位置 以 及 目的特定转基因鼠系中开关蛋白表达盒数影响。
来源：丁香实验
