髙通量方法筛选聚合物转染试剂

髙通量方法筛选聚合物转染试剂

材料

试剂
Bright-Glo Kits (Promega)

C0 S7 细胞，一种非洲绿猴的肾成纤维细胞系，适合被需要表达SV40 T 抗原的载体 转 染（ATCC: CRL-1651)

二 甲 亚 砜（DMS0, >99. 7% 无菌 过 滤）（Sigma-Aldrich)

DMEM 培 养 基 [每 500 ml 含 50 ml 胎 牛 血 清（F B S ) 和 5m l 青 霉 素 - 链 霉 素 (Invitrogen 21063-029, 10082-147, 25200-056)

蜜 火 虫 莖 光 素 酶（Prom e g a )

p C M V - Luc D N A (l m g / m l 水 溶 液 ，一 20°C 储 存 ）（ElimBiopharmaceuticals)

支 化 P E I ，分 子 质 量 25k D a (Sigma-Aldrich)

乙 酸 钠 溶 液（3mol/L , p H 5.2， 0.2um 膜 过 滤 ）（Sigma-Aldrich)

膜 蛋 白 酶（Invitrogen 25200-056)

仪器

12 道 吸 液 器（V&~undefinedP Scientific) , 高压蒸汽灭菌

离 心 管（15 ml, 无菌）

96 孔 板（Corning CJstar 3695)，在带层流的细胞培养超净台 U V 照 射 I h 消毒

细胞计数板（VWR)

培 养 箱（37°C ， 5% C 〇 2; FormaScientific)

小 离 心 管（1.5 ml，无菌； Eppendorf， VWR)

微量移液枪（Eppendorf)

5〜50ul 1 2 通道

50〜300ul 1 2 通道

100〜IOOOul 单通道

2 0 〜200ul 1 单通道

涡旋振荡器（备选）

移液枪头，高压蒸汽灭菌 30 min

1〜200ul 4 盒（U. S. Scientific)

100〜 IOOOul (U. S. Scientifio)

移液池，无 菌（VWR)

细 胞 板（96 孔）

多孔平底带盖板（2 块； BDFalcon, 无菌， BD 353072)

多 孔 板 ， 96 孔（2.4m l)， V 形 底 ， Greiner Polypropylene (Sigma-AldrichM1561)

组织培养板，白色 96 孔 板（无菌； Corning Costar 3917)

营光素酶板计数仪（Perkin Elmer)

计 时 器（VWR)

组织培养滤器， 500 ml， 0.2 um 醋酸纤维素膜（无菌； Nalgene)

水浴，室温

方法

所 有 的 操 作 都 必 须 在 层 流 细 胞 培 养 超 净 台 中 完 成 ，所 有 试 剂 和 设 备 均 经 无 菌 处 理 。我 们 假 定 读 者 熟 悉 基 本 的 无 菌 细 胞 培 养 技 术 ，包 括 细 胞 生 长 、传 代 和 接 种 细 胞 。

1.在 转 染 前 一 天 ， 以 每 孔 1.5 X IO⁴ 在 白 色 细 胞 培 养 9 6 孔 板 接 种 C 0 S -7 细 胞。

2 . 在无菌的小离心管中，用 200ul DMSO 溶 解 20m g 不同聚合物，制 备 100 mg/m l 的聚合物溶液。用 Iml DM SO 溶 解 IOmg P E I，制 备 lOmg/m l 的 P E I 溶液作为阳性对照。

3 . 用 495. 8m l 蒸馏水稀释 4.2m l3mol/L 的乙酸钠溶液，配 置 500m l25 mmol/L 的乙酸钠 缓 冲 液（pH 5. 2)，用 Nalgene 组织培养过滤器真空过滤除菌。

4 . 吸 取 30 ml 25 mmol/L 乙酸钠缓冲液到移液池中，用多通道移液枪在 BD Falcon 9 6 孔板 的 A 和 B 排 中 分 别 加 人 l 76ul 和 8 〇ul 上 述 缓 冲 液。按这一操作方法 ，最终聚合物和 D N A 比例将分别为 20 : 1 和 1 〇〇 : 1。此 外 ，在 Greiner 9 6 孔 V形底板的 A 排中，每孔加入 900ul缓 冲 液。

5 . 室温水浴解冻 pCMV-Luc D N A 储液，在 15m l 无菌离心管中，用 9. 4 ml 25 mmol/L的乙酸钠缓冲液稀释 600ul lm g /m l 的 D N A 储液。将稀释的 D N A 溶液转移到移液池中，向 96 孔板每孔加25ul )。

6•在 37°C 水浴温浴培养液 15 min。转移培养液到移液池中，在 BD Falcon 9 6 孔板中每孔 加 入 200u l 培 养 液。

7•在 Greiner 9 6 孔 板 的 A 排（含 900ul乙酸钠缓冲液），对 应 加 人 lOOmg/m l 的聚合物/DMSO 溶液和阳性对照，每 孔 100ul (图 1，板 1)。用移液枪混勻以确保聚合物溶解均匀。

以下所有转移操作均用 12 通道移液枪完成。

8 . 准备聚合物稀释液（图 1 , 步 骤 1):

a. 从 Greiner 9 6 孔板 的 A 排 转 移 24ul聚合物溶液到含有 176ul乙酸钠缓冲液的聚合物溶液稀释板的 A 排中。

b•从 Greiner 96 孔 板 的 A 排 转 移 120^1 聚合物溶液到含有 80ul 乙酸钠缓冲液的聚合物溶液稀释板的 B 排中。

c. 用移液器吹打溶液，确保溶液混合均匀。

9 . 准备聚合物-D N A 复 合 物（图 1 , 步 骤 2)

a. 从聚合物溶液稀释液板的 A 排 ，转 移 25m1 聚合物溶液，依次加人到含 25ulDNA 的 DNA 板 的 ABCD 四排中。

b. 从聚合物溶液稀释液板的 B 排 ，转 移 25W 聚合物溶液，依次加入到含 2 5 4D N A 的 D N A 板 的 E F G H 四排中。

c. 计 时 5 min。每一次转移均用移液枪反复吹打，以确保溶液混合均勻并促进聚合物-DNA 结合。每次加样前要换枪头，防止孔间污染。混合技术对获得可重复的转染结果非常重要。

10.5m in 后 ，从 D N A 板 的 A 排吸取 30M1 聚合物-D N A 复合物，加人到每孔含 200ul 培养液的培养液板的 A 排 中 （图 1，步 骤 3)，依次重复其他排的操作。每一次加样均用移液枪吹打几次，确保溶液混合均勻。每次加样要更换枪头，防止孔间污染。

11•将聚合物-DNA 复合物加人到细胞中 （图 i ，步 骤 4)。

a. 用 12 通道的吸液器吸去整块细胞培养板的培养液，确保培养液吸净。

b. 从培养液板的 A 排中，吸 取 I 5O mI 聚合物-DNA 复合物到细胞培养板的 A 排中。

c•依次重复其他排的操作。每次加样更换枪头。加样时，枪头与细胞培养板成一角度，沿孔壁加人，避免直接在细胞的上方加样，以减小加样带来的液体流动和涡旋力，从而避免将细胞冲悬。

d. 将细胞放回到培养箱中，计时培养 lh 。

12.I h 后，从细胞中吸除聚合物-DNA 溶液，每 孔加人 105ul 新鲜培养液，继续培养细胞。

13•分析萤光素酶蛋白的表达。萤光素酶蛋白表达的分析通常在转染后 1〜5d 进行，对于 CO& 7 细胞，转染后 3d 比较合适。

a. 室温水浴解冻 Bright Glo Luciferase Assay Kit 至少 lh 。

b. 将缓冲液加入到底物管，盖好，倒转几次以混勻，转移到移液池中。

c•用多通道移液枪，在细胞板每孔中加人 100ul 溶液，加完后，计 时 2 m in , 轻摇板 ，或用涡旋振荡器混合。

d. 2 min 后 ，在读板仪上测量萤光强度, 时间为 Is 。对应于标准曲线，计算萤光素酶蛋白表达的量。