用比较基因组杂交描述染色体结构异常实验

一、正常男性外周血细胞的培养

1.将核型正常男性的500〜650μL新鲜全血加入10mL启动培养基中。

2.37℃条件下培养约72h(3d)。

3.加入200mL胸苷溶液，轻轻混匀。

4.37℃培养14〜18h(过夜)。

5.155g离心10min。

6.弃去上清，加入10mL 1×PBS，颠倒混匀。

7.155g离心10min。

8.弃去上清，加入10mL连续培养基，轻轻颠倒混匀。

9.37℃条件下继续培养4〜5h。

10.加入6或7滴秋水仙胺溶液，颠倒混匀。

11.37℃水浴锅中培养20min。.

12.170g离心10min。

13.弃去上清，留约0.5mL液体。轻弹离心管几次，彻底重悬细胞，避免细胞结块。迅速加入0.5mL 75mol/L KCl(预热在37℃)，轻弹离心管充分混匀，继续加入4.5mL KC1。

14.37℃水浴锅中孵育15min。

15.用巴斯德吸管，向每个管中从管底开始缓缓加入1mL新鲜配制的固定液，轻轻颠倒混匀。

16.170g离心10min。

17.弃上清，残留约0.5mL液体。

18.边混匀边逐滴加入新鲜固定液至5mL。

19.室温孵育约10min。

20.170g离心10min。

21.弃去上清，残留约0.5mL液体，将沉淀打散。

22.边混匀边逐滴加入新鲜固定液至5mL。

23.必要的话，再重复步骤20〜22，2或3次。

24.弃去上清。

25.稀释沉淀至适当浓度。溶液应混浊、轻雾状（如果得到沉淀较多，加入1〜1.5mL固定液；如果得到沉淀较少，加入<1mL固定液）。

26.按下述二所述方法滴片。

二、正常男性中期染色体标本的制备

1.准备一个封闭环境，其相对湿度约55%(可在50%〜60%变化），温度24〜26.5℃。

2.将巴斯德吸管置于玻璃载片上方2〜4in处，让一滴细胞悬液滴在玻片的左侧。然后迅速将第二滴细胞悬液滴在玻片右侧（见注释7)3.在固定液全部蒸发前，将玻片浸入盛有新鲜固定液的染色缸1〜3s，将玻片自染色缸中取出，在如步骤1所述的封闭的湿度/温度环境中晾干片子。

4.在光学显微镜T检查染色体标本的质量。

5.染色体标本在室温下过夜，然后浸入1%福尔马林中4℃固定5〜10min。

6.染色体标本系列乙醇脱水，70%、85%和100%乙醇中各2min。

7.标本在室温下晾干，或在实验室抽风橱中微风吹过标本使标本快速干燥。

8.在室温储存标本2〜4周。

9.用正常参考与正常人样品或已知不平衡性染色体异常样品，对其中一张染色体标本片进行CGH分析。

三、患者和正常人样品高分子质量DNA的提取

按照生产商提供的说明书进行DNA提取。也可以选择用标准方法或任何可靠的DNA提取试剂盒提取DNA。

四、用缺口平移法标记探针

1.荧光素-12-dUTP用于标记患者DNA，德克萨斯红-5-dUTP用于标记参考DNA。

2.准备15℃水浴锅，或向装满自来水的冰盒中加入少量的冰直到温度降到15℃。

3.将另一个水浴锅设置为72℃。

4.向1.5mL离心管中加入下述试剂（所有试剂置于冰上）：1μg患者或参考DNA、5μL 10×反应缓冲液混合物、5μL dNTP混合物、1μL荧光基团-dUTP(l mmol/L)、1μLDNA酶（0.01〜1U/μL)和2.5μLDNA聚合酶I(10U/VL)。

5.加水至总体积50μL。

6.将离心管短暂离心，使所有试剂都沉至管底。

7.在15℃水浴中孵育60min。

8.在72℃水浴中孵育10min终止反应。

9.在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检查DNA片段大小。最适于CGH的DNA片段大小为300〜2000bp(图3)。如果片段太长，加入DNA酶I在15℃水浴中继续孵育。

10.可以进行大量样品的缺口平移标记。

五、CGH探针的制备在1.5mL离心管中加入下述试剂：

1.用缺口平移法标记好的正常（参考）DNA200ng。

2.缺口平移法标记好的患者DNA200ng(10iLtL)。

3.20〜30μg Cot1-DNA(20〜30μL)(见注释11)。

4.1/10体积的3mol/L乙酸納。

5.150μL(大于2倍体积）100%冰冷乙醇。

6．在-80℃放置40〜60min。

7.29000g(或离心机最大转速）于4℃离心40min。

8.轻轻倒掉乙醇。

9．用无菌的有棉花尖头的涂布器吸干残余的乙醇（不要碰到沉淀）。

10.将离心管置于电热板（42℃)上的金属架上，蒸发残余的乙醇，需时2〜3min。

11．用101μL Hybrisol VII杂交混合物重悬沉淀，用上下抽吸混匀，涡旋振荡约1min.

12.CGH探针可以直接使用或于-20℃避光保存备用

六、中期染色体标本的变性

1.在染色缸中加入大约50mL变性液，将染色缸放于75〜76℃水浴中。预热变性液使其温度达到（73±2)℃。

2.从-20℃冰箱中取出实验所需的标本，室温下系列乙醇脱水，各2min。

3.室温干燥片子（5min)，或在实验室抽风橱中微风吹过标本使标本干燥。

4.在37〜40℃电热板上预热片子30s。

5.将标本浸入（73±1)℃的变性液中变性2.5〜5min。

6.迅速取出标本，放入冰冷的70%乙醇中3min，然后在85%和100%乙醇中脱水各3min。

7.晾干标本玻片（5min)，或在实验室抽风橱中微风吹过标本使标本干燥。

七、探针变性

在中期染色体标本片系列乙醇脱水的同时，将装有CGH探针的离心管在(75±1)℃水浴中变性10min。

八、杂交

1.将注射器针筒（已将枕头去掉）中吸入橡皮泥。

2.将标本片在37〜40℃电热板上预热片子约1min。

3.标本片在电热板上，将每个CGH探针加到标本的同一个杂交区域上，每个杂交区域盖上22mm×22mm玻璃盖玻片。

4.用注射器挤压橡皮泥，沿着盖片边缘进行封片。

5.37℃湿盒中孵育标本2〜3d。

九、杂交后洗脱

1.在染色缸中加入大约50mL的2×SSC溶液，预热使其温度达到72℃左右（水浴锅温度设置在大约75℃)。

2.在染色缸中加入大约50mL的4×SSC溶液，预热使其温度达到37℃左右（水浴锅温度设置在大约39℃)。

3.在染色缸中加入大约50mL的4×SSC/0.1%Triton×-10O溶液，预热使其温度达到37℃左右（水浴锅温度设置在大约39℃)。

4.在染色缸中加入大约50mL的2×SSC溶液，室温放置。

5.在染色缸中加人大约50mL的蒸馏水，室温放置。

6.从标本片上除去橡皮泥。

7.轻轻滑掉盖片（不要划伤标本)。

8.将标本片置于（72±2)℃的2×SSC溶液中，晃动标本片2min，然后在该溶液中停留5min。

9.将标本片转移到37℃的4×SSC溶液中放置5min。

10.将标本片转移到37℃的4×SSC/0.1%TritonX-100溶液中放置5min。

11.将标本片转移到37℃的4×SSC溶液中放置5min(可使用与步骤9中的同一溶液)。

12.将标本片转移到室温下的2×SSC溶液中停留5min。

13.将标本片转移到室温下的水中停留5min。

14.标本片自水中取出，置于暗处室温晾干；或在实验室抽风橱中微风吹过标本使标本快速干燥。

15.在标本片的靶区域上加10μL DAPI复染剂。

16.盖上盖玻片。

17.将标本片置于暗处5〜10min，然后进行CGH图像抓取和分析。

18.拍摄至少常染色体各10个，性染色体各7个。

1.一般选择正常男性对照，这样使得一张中期染色体标本片中同时有X染色体和Y染色体。

2.如果初步细胞遗传学分析已在其他实验室完成，患者的血样应放入有肝素钠的管中，可随后进行提取DNA或需要的话进行外周血培养用于FISH实验。在这种情况下，采血量最好超过3mL。如果患者是婴儿，采血量通常小于3mL，只要血量足够进行DNA提取即可。

3.可以提取大量男性和女性参考DNA，储存在-20℃备用。

4.每批新的DNA酶要进行0.0〜0.1U/mL的浓度梯度实验，通过琼脂糖凝胶电泳以确定哪种浓度能得到最理想大小的DNA片段，一般用该浓度的DNA酶进行标记效果理想。

5.—次标记超过1μgDNA可得到大量的标记参考DNA，可歸存在-20℃。

6.应制备一张标本片进行预试验以确定有丝分裂指数，评估是否需要用固定液稀释细胞悬液，或离心后用较少体积的固定液重悬细胞。

7.—张载片上滴两个区域，可以在一张片子上同时进行两个不同的CGH实验，但是应确保两个区域的染色体都分散良好。

8.进行中期染色体标本片的制备，其目标是：①得到的中期染色体分散均匀、相当染色体臂比较直、染色体之间重叠较少；②载玻片和染色体上残留的细胞质尽可能少；③相差显微镜下观察中期染色体呈现灰色[不太黑和（或）太亮，也不太浅或太朦胧]。

9.中期染色体标本片的质量是CGH过程中最关键的因素。每批标本片都应进行预实验，质量比较好的标本片储存在-20℃。在滴制片后约两周进行预实验，一旦结果满意，在-20℃储存这批标本片。一般整批标本片的质量相似，如果一批标本片没有得到满意的结果，这批标本片可以用于其他实验如FISH，或扔掉。在精通中期染色体标本制备的实验室中，应该首选他们常用的中期染色体制备方法。许多情况下，能满足注释8中标准的中期染色体同样适合CGH分析。

10.制备CGH探针时，应考虑制备两种不同的探针，一种是与患者性别相同的参考探针，另一种是性别不同的参考探针。性别相同的探针在揭示染色体(包括性染色体）的不平衡性染色体异常时非常重要。如果一张片子的两个杂交区域采用两种探针（见注释7)，性别不同的参考探针可以作为内对照，因为预期整条性染色体颜色比率不同。

11.标记病例（marker case)中采用约20μgCot1-DNA，而所有其他病例中采用约30μgCot1-DNA。绝大多数的标记染色体含有着丝粒，对于某些病例采用较少的Cot1-DNA提高检测效能。

12.变性液应预热至少30min。溶液可在微波炉中用最高档20s以加速预热过程。

13.确定每批标本片的最适变性时间。合适的标本在较大范围的变性时间内都可得到好的杂交结果和DAH反转带型。最初变性时间可以尝试3.5〜4min。