材料与仪器
步骤
水溶性脂高分子/pDNA 及脂肽/pDNA 复合物的制备及使用
材料
试剂
重要：所有的溶剂均为 HPLC 级
支化聚乙嫌亚胺（PEI; 1800Da; Polysciences)
C T -26 结肠癌细胞
氯甲酸胆固醇酯
乙醚
二异丙基乙胺溶液（DIPEA; l m o l /L ， 溶于 DMF)
二甲基甲酰胺（D M F )
溴 化 乙 锭（0.5 ug/ml 于 1X T B E )
胎 牛 血 清（F B S )
5 % 葡萄糖注射液
盐 酸（H C 1; 0. lm o l/L )
石胆酸
甲醇
二氯甲烷
小 鼠（5 周龄 BAXJB/c; Simonsen Laboratories)
磷酸盐缓冲液（P B S ; 组织培养级）
报道基因： C M V 启动子驱动的编码萤光素酶的质粒 D N A ( p C M V _Luc)
R P M I 1640 组织培养基
治疗基因： p2C M V m I L -12, 编码 鼠 i l - 2 亚 单 元 P3 5 与 p4 0 , 分别受独立的 C M C启动子转录控制
三乙胺
三 氟 乙 酸（T F A ; 9 5 % 与 5%)
Tris-硼酸-EDTA 缓 冲 溶 液（TBE; 商购或按配方配制，参 见 S a m b r o o k a n d Rus_sell 2001)
O-(N-琥珀酰亚胺基)-N， N， N’，N’-四甲基脲四氟硼酸酯（T S T U ) 溶 液(l m o l / L 溶 于 D M F )
仪器
琼脂糖凝胶电泳设备
联辛可宁酸（B C A ) 总蛋白质定量分析试剂盒（Pierce)
m I L -12 p70 酶联免疫诊断试剂盒（E L I S A ) (Pharmingen)
高效液相色谱仪（H P L C )，包括 C 18 柱（V y d a c)
luminometer (Dynex Technologies)
基体辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（M A LD I-T O F ) ( ^ PerspectiveVoyagerD E S T R ， Applied Biosystems)
核磁共振波谱仪（N M R ) (Varian)
多肽合成议（如 Applied Biosystems 433A peptide synthesizer) 及相关设备
标准组织培养设备及辅助设施
Zeta 电位分析仪（Z e t a P A L S ， Brookhaven Instruments)
方 法
水溶性脂高分子的合成与表征
1 . 将 3 g PEI (1800D a) 与 IOOmI 三 乙 胺 溶 解 于 IOml 无水二氯甲烷，于冰浴中搅祥 30 min。
2.将 I g 氯甲酸胆固醇酯溶于 5m l 冷的二氯甲烷中，缓慢加入上述 PE I 的溶液中，冰水浴中坪拌 12 h。产物经干燥后，溶 于 50m l0.1mol/L 的 HCl 溶液中，过滤。
3.用 l00m l 二氯甲烷萃取上述水溶液并过滤，滤液浓缩后，沉淀于大量丙酮中，干燥。用甲醇和乙醚洗涤。
4 . 通 过 MALDI-T0 F ，以反式-4-羟基-3-甲氧基肉桂酸为基质，验证产物分子质量。用 1 H NMR 验证其结构。该水溶性脂高分子于一 20°C 下可以保存 6 个月。
水溶性脂肽的合成与表征
![5 . 合成以下脂肤： His-His-T y r -A r g -A r g -A r g -His-C y s-Ser-A r g -A r g -A r g -L e u -His~H i s 。 这一序列对应于人鱼精蛋白51〜6 3 的氨基酸残基，除了以赖氨酸代替5 7 位半胱氨 酸外，另外在氨基端与羧基端增加了组氨酸残基。肽的合成使用标准的F m o c 固相 合成法，以 2, 2, 4, 6, 7-五甲基二氢苯并呋喃-5-横 酰 基 （2 , 2 , 4 ， 6， 7卞6加3111- ethyldihydrobenzofurane~5-sulfonyl， P f p) 保护精氨酸的侧基，以 三 苯 甲 基 （T r t) 保护组氨酸侧基， 1-(4， 4-二甲基-2， 6-二氧杂亚环己基）3-甲 基 丁 基 [1-(4， 4- dimehyl-2, 6-dioxocyclohexylidene)3-methylbutyl， D d e ] 保护赖氨酸侧基。用叔丁 氧 羰 基 （t-B o c) 保护其他氨基酸。 6•用5 % 的 T F A 处理固定于树脂上的合成多肽，使赖氨酸的e■氨基从D d e 脱保护。用 1 0 0 % 甲醇洗几次。这一步骤得到约50M m o l 的多肽，并进行下一步反应。 7•将lOOpmol/L TSTU溶 液 （lmol/L 溶 于 DM F中）逐步滴入到含3 倍摩尔质量的 DIPEA (lmol/L 溶 于 DMF中）的 IOOmI 的石胆酸溶液中（l m〇 l/L 溶 于 DM F中）， 室温下轻摇2h。 8 . 将步骤6 中带有肽的树脂加入到 T S T U /石胆酸/DIPEA 混合溶液中，室温下轻 摇 12h 。](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/08/A1470389694056qciz9q4jwjpng_small.jpg)
![9 . 用 D M F 洗涤反应物。室温下用9 5 % 的 T F A 处 理 90m i n 以使肽从树脂上断裂下来。 以 I O O O g 的转速离心分离树脂。利用带反相C 18柱 的 H P L C 分离纯化肽。通过氨基 酸分析确认肽的组成，并 利 用 M A L D I - T O F 质谱测定其分子质量，测量酪氨酸在 274. 5n m 的吸光值确定肽的浓度[ e274.5 = 14： 00L / (m o l . c m )]。 脂高分子/pDNA及脂肽/pDNA/复合物的制备 10•在5 % 的葡萄糖溶液中，以 1〜2 5 的不同N / P 比，混 合 p D N A 与 脂 高 分 子 （或脂 肽） ，室温下静置15〜20m i n ，以制备脂高分子/ p D N A (或脂肽/p D N A ) 复合物。 N / P 比是指水溶性脂髙分子及脂肽中N 原子数与质粒D N A 中磷原子的比例。 11. 于 I X T B E 中用琼脂糖凝胶电泳分析上述复合物。以 O.Sfig/m l 的溴化乙锭进行染 色，并 在 U V 灯下观察。 12. 用 Z e t a P A L S 测量复合物的平均粒径及电势。 体外转染及萤光蛋白酶活力分析 13•在37°C ， 5 % C 0 2 培养箱中，用 含 10% F B S 的 R P M I 1640培养基培养C T -26结肠 癌细胞。 14.在 6 孔板中以每孔3X 105 的密度接种C T -26细胞，使用含10% F B S 的 R P M I 1640 培养基。在细胞达到7 0 % 密度时，用新制的脂高分子/p D N A 或脂肽/p D N A 复合物 转 染 C T -26细胞，剂量为2.5M g /孔 ，使用无血清的培养基。 15•将复合物与细胞于37°C 、 C O 2 培养箱中培养6h 后，用 2m l 完全培养基替换旧培养 基 ，并继续于37°C 培养36h 。 16. 用 P B S 洗细胞。裂解细胞，用 B C A 总蛋白质定量试剂盒测定蛋白质总量。 17. 用 I u m i n ometer测定萤光素酶的活力，并以蛋白质总量归一化R L U 值 。 瘤内基因传输 18. 在5周龄6八1^/(；小鼠左侧皮下注射以106个(：丁-26细胞以成瘤。 10〜15€ 1后，肿 瘤体积为100〜120m m 3。 19. 以 每 只 荷 瘤 小 鼠 25鸿 质 粒 D N A 的剂量瘤内注射5〇 4新鲜制备的脂高分子/ p2C M V m I L -12 或脂肽/p2C M V m I L -12 复合物。注射 P2C M V m I L -12 裸 D N A 及 5% 葡萄糖作为对照。 20. 单次瘤内注射后，观测小鼠肿瘤生长情况。在 48d 内，记录肿瘤体积的变化。 21. 注射48h 后分离肿瘤组织，将肿瘤组织切成小片， 37°C培养24h ，通过 E L I S A 分析 培养液中m I L -12 p 7 0 的浓度。](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/08/A1470389702932mw6e87s8ufpng_small.jpg)
来源：丁香实验
