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    基因组靶序列荧光原位杂交探针的标记

    相关实验：基因组靶序列荧光原位杂交探针的标记实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    待标记的样品DNA 荧光素标记的dUTP 0. 3mmol L dATP 0. 3mmol L dCTP 0. 3mmol L dGTP 0. 3mmol L dTTP 待标记的胺修饰DNA
    缺口平移酶混合物 10 X 缺口平移缓冲液 反应终止液 乙酸钠 乙醇 TE 溶液 TAE 缓冲液 琼脂糖 I X TBE 电泳缓冲液 乙酸铵 无水乙醇 PBS TBS
    温育装置 Sephadex G-50 型离心柱 小离心管 微型离心机 离心干燥器 微量移液器 电热板 紫外透射仪 流式细胞仪 离心柱 超声波破碎仪

    步骤

    一、缺口平移

    缺口平移是一种将标记核苷酸掺入到D N A 中的方法，这 些 DNA 可以是孤 立 的 DNA片段或是一个完整克隆[39’ 4°]。该方法利用两种酶的联合作用： DNA 酶 I 在 DNA链上打开缺口形成Y端轻基， DNA聚合酶I 在 Y端羟基上加上核苷 酸 。随 着 DNA 聚合的进行， D NA 聚 合 酶 的 5'— 3'外切核酸酶活性将缺口 5'端 的核苷酸水解。反应进行过程中标记的和未标记核苷酸掺入，各 种 大 小 的 DNA 片段被合成，但 是 没 有 D N A 的净合成。产 生 的 双 链 D N A 片段在杂交前必须 变性。 1 . 制备 0. lmmol/L dTTP 溶液：将 IOOjuL 0. 3mmol/L dTTP 加入到 200PL 无核酸酶的水中。 2 . 制备 0. lmmol/L dNTP 混 合 物 ：将 0.3mmol/L dATP、 0. 3mmol/L dC TP和 0. 3mmol/L dG TP各 IOOjUL混合。多余的核苷酸混合物可在一20°C 或 一80°C保存。 3 . 对 于 每 个 标 记 反 应 ，在 放 置 在 冰 上 的 小 离 心 管 中 加 入 Iyg DNA、 0. 2mmol/L 突 光 基 团 标 记 的 dUTP 2.5/JL、 0. lmmol/L dTTP 5juL、 0. lmmol/L dN TP混 合 物 1(^L 、 10X 缺口平移缓冲液5juL，加 无 核 酸 酶 的 水 到 40斗 （见注 释1)〇 4 . 每个小离心管中加入缺口平移酶混合物IOjuiL 。 5 . 混匀并稍离心。 6 . 在 15°C条件下温育8〜16h 。 7 . 加 入 5JUL反应终止液。 8 . 为了去掉未掺入的核苷酸，加 入 乙 酸 钠 、 125juL无水乙醇， 用 12 000r/m in 的离心速度离心20〜30min。小心地倒掉上清或用微量移液器吸 去上清。加入1〇〇 1^70%乙醇，稍振荡，用 15 00(^离心51^11。小心地倒掉上 清或用微量移液器吸去上清（见 注 释 2)。
    9..用真空冷冻干燥器处理样品.10〜20min。用 IOpL T E 重悬沉淀，使终浓 度 约 为 lOOng/^L (见 注 释 3 和 4)。也 可 以 用 Sephadex 0 5 0 型离心柱去掉未掺 入的核苷酸，操作步骤按照产品说明书进行。用离心柱处理后，标 记 DNA体积 范 围 为 50〜IOOjuL ，然后按照步骤8 进行浓缩。 10. 为了确定标记DNA片段的大小，在 50mL T A E 或 T B E 缓冲液中加入 〇 .5g 琼脂糖，用微波炉或电热板小心加热至沸腾。当琼脂糖全部溶解，在水浴 中降温至55°C 。 11. 在琼脂糖中加入2. 5pL EB 混匀后，将琼脂糖倒在具有1 2 孔 或 1 6 孔梳 子的铺胶板上。 12. 对于每个标记DNA样品，将 2MLDNA (约 200ng) 、 7^L 水 （T A E 或 TBE) 和 I 1 UL上样缓冲液混合。 13. 将每个标记样品和分子质量参考在70〜IOOV下电泳，直至前面的染液 在凝胶中迁移约5cm。 14. 在 紫 外 投 射 反 射 仪 上 观 察 DNA，并 拍 照 。大 部 分 的 D N A 片段应 在200〜600bp

    二、随机引物标记

    随机引物标记是通过所有可能的六聚体、八聚体或九聚体核苷酸与变性的 D NA 复性进行标记的一种方法[41’ 42]。这些小的寡聚核苷酸作为引物，通 过 Klenow 酶催化掺入标记和未标记的核苷酸，使 互 补 DNA链合成。标记物是双链和 单 链 DNA 片段的混合物，因此在杂交前需变性。 1 . 制备1〇父4!^13 混 合 物 : 终浓度为1111111〇 1/1^€ 1八丁？、 1111111〇 1凡〇 1(：丁？、 lmmol/L dGTP、 0. 3mmol/L 荧光基团标记的 dUTP 和 0. 7mmol/L dTTP〇 多 余的核苷酸混合物可在一 2〇°C或一 80°C保存。 2 . 用 20juL无核酸酶的水溶解DNA (最 好 为 400〜500ng，见 注 释 5 和 6)。 3 . 加 入 20juL2.5X 随机引物缓冲溶液。 4 . 在沸腾的水中变性5min，然后快速放在冰上。 5 . 在冰上加入5JUL10X dN TP混合物、 4斗 无 核 酸 酶 的 水 ，使最终的溶液 体 积 为 49juL。 6 . 混匀并稍离心。 7 . 加 入 1/aL Klenow酶混勻，稍离心。 8 . 在 37°C条件下温育1〜6h ，较 长 的 温 育 时间通常会提高产物量（见注释 7)。 9 . 加 入 5P L 反应终止液。 10. 加 入 5&L 3mol/L 乙 酸 钠 、 1 2 5 ^ 无 水 乙 醇 ，用 15 OOOg离 心 20〜
    30min，去除未掺入的核苷酸和引物。小心地倒掉上清或用微量移液器吸去上 清 。加 入 IOOjuL 7 0 % 乙醇，稍振荡，用 15 OOOg离 心 5min。小心地倒掉上清或 用微量移液器吸去上清。 11. 用真空冷冻干燥器处理样品1〇 〜2〇 min。用 2 0 斗 T E 重悬沉淀，使终浓 度 约 为 lOOng/juL。也可以用Sephadex 0 5 0 型离心柱去掉未掺入的核苷酸，操 作步骤按照产品说明书进行。用离心柱处理后，标 记 DNA 体 积 为 50〜lOOyL， 按 照 步 骤 1 0 进行乙醇沉淀浓缩。 12. 最适的片段大小在200〜600bp，可通过电泳进行判定。电泳的操作步 骤参照本章3 . 1 中的步骤10〜14。

    三、DOP-PCR

    显微切割或流式分选的染色体经过PCR扩增制备整条染色体的DNA，被认 为是对某条染色体全部涂染的高质量探针的首选途径。对于单个染色体、多色 FISH (M-FISH)[43]或光谱核型分析[44]中 所 有 2 4 条染色体的涂染均是此种情 况 。下面提供的操作程序[45]是简并寡核苷酸引物PCR (DOP-PCR) 最原始操作 程序[38]的 修 改 版 本 ，适 于 用 SpectrumOrange™ dUTP 或 SpectrumGreen™ dUTP (Vysislnc.) 扩增染色体DNA。此操作程序稍做修改或不做修改，就可 以用各种其他的标记dU TP扩增染色体DNA。反应涉及的寡核苷酸，其 5'端有 XZioI限制性内切核酸酶酶切位点， 3'端有确定的寡聚六核苷酸序列和中间有一 系列简并核苷酸序列（所有四核苷酸的随机混合） 。从理论上计算表明在整个基 因组中每4k b 就有一个这种确定的六核苷酸序列。在合适条件下，用此序列作 为引物的扩增可绕过特定的3'序 列 ，也许通过一个或更多的简并核苷to 进行退 火提髙稳定性[38]， 5'端特定序列使得该引物在较高的温度退火。在实际应用中， DOP-PCR操作程序开始的几个循环中用低退火温度（低 保 真 PCR) ，然后进行 多个循环的高退火温度（高 保真PCR)，产生随机扩增的DNA混合物。 流式分选的染色体一般通过两轮DOP-PC R 的扩增，其产物在荧光标记的三 磷酸核苷酸存在的条件下进行第三轮扩增而得到标记。虽然缺口平移方法也可以 用于标记进行染色体分析的探针，但获得高质量探针一般不需该步骤。 3. 3.1 D N A 的扩增 一般来说，流式分选的染色体进行重悬并在PCR分析缓冲液中扩增， PCR 条 件 为 ： 95°C 、 5min，然后 9 个 循 环 的 94°C 、 lm in， 30°C 、 1.5min， 72°C 、 3min，升 降 温 时 间 为 2min、 5s ; 接 下 来 进 行 3 5 个 循 环 的 94°C 、 15s ， 62°C 、 15s ， 72°C 、 15s (见 注 释 8〜1 0 ) ; 然 后 进 行 单 独 72°C 延 伸 lOmin，最后保存在 4°C 。 上 述 PCR 产 物 在 IOOyL体系中按照同一 PCR条件进行再扩增。 IOjuL
    扩增产物在1 % 的琼脂糖凝胶上电泳，形 成 大 小 为 300〜 IOOObp的成片条带。 DNA 的最终产量在1. 5〜3. Opg (见 注 释 11)。 3. 3. 2 DNA 标记 1 斗 上 述 PCR产物在PCR标记缓冲液中，用 扩 增 D N A 的 PCR条件进行标 记 。 1〜2|u L 的标 记DNA不用纯化就可直接用于杂交。

    四、用脂族胺标记DNA探针

    除了用聚合酶掺入标记核苷酸的一步探针标记法，也可以用两步标记程序， 包括：①应用上述聚合酶标记探针程序（见 本 章 3.1〜3. 3 ) 将脂族胺取代基掺 人 探 针 DNA; ② 将 修 饰 的 D NA 与胺活化荧光基团进行连接。两步标记程序使 得任何胺活化荧光基团可以与修饰的DNA进行结合，而不是只用与三磷酸核苷 结合的荧光基团商业化产品。另外，所有聚合酶标记程序可以用同样的三磷酸核 苷-烯丙胺- dU TP，因此单一的聚合酶反应条件就可以用于所有荧光标记，无需 对不同三磷酸核苷荧光基团进行反应条件最优化试验。同时，烯丙胺-dU T P 的 掺入比其他核苷酸的掺入更有效。用两步标记程序对烯丙胺-dU T P 进行标记的 试 剂 盒 现 已 有 售 （ARES标记试剂盒， Molecular Probes, Inc. ， Eugene, OR)。 应用烯丙胺-dU TP代替标记三磷酸核苷，脂族胺通过酶促反应掺入dN A ， 从而可以按照下述步骤与胺活化荧光基团、生物素或半抗原结合。该步骤同样可 以用于通过其他一些化学方法掺入的脂族胺探针的标记[22’ 46]。这包括含有通过 亚 磷 酰 胺 化 学 （核酸化学合成）掺入的脂族胺修饰的碱基，或 3'或 5'胺修饰末 端合成的DNA、 R N A 和 PN A 寡聚体。 1 . 用适当的反应缓冲液溶解胺修饰DNA，最终浓度为0.6〜I .OmL反应缓 冲液中有IOnmol脂族胺。 2 . 在适当的溶剂中溶解胺活化标记化合物，终 浓 度 为 10〜20mmol/L 。 3 . 在胺修饰的D N A 中加入多于5 0 倍 （异硫氰酸）或 100〜200倍 （羟基丁 二酯或氯磺酸）摩尔的胺活化染色剂（见 注 释 12)。 4 . 将反应溶液在室温条件下搅拌过夜。 5 . 利用水或T E 平衡和洗脱的Sephadex 0 2 5 型离心柱，用凝胶渗透层析方 法将探针和未结合的标记物进行分离。标 记 的 探 针 洗 脱 在 已 占 体 积 内 （见注释 13)。 6 . 将标记的探针在4°C或更低的温度条件下保存备用

    五、ULS标记

    Universal Linkage System (ULS®; KREATECH Biotechnology BV，阿姆 斯特丹，荷兰）是用铂染色络合物与鸟嘌呤核苷的N7 残基反应进行标记的方法。 反应使核酸与铂荧光基团之间形成稳定的化学键。依据反应条件， U LS化合物 在较低的程度上也与腺嘌呤形成络合物。该方法已用于DNA (包括质粒，黏粒， 分子质量参考物，在低熔点琼脂糖中的DNA、 BAC、 PAC、 YAC，全染色体文 库 ， DOP-PCR产 物 ，如 卫 星 、着 丝 粒 和 端 粒 D N A 的高度重复序列） 、 RNA、 PNA、寡聚核苷酸和扩增的核酸产物[16’ 47]。在 Molecular Probes公 司 （Eugene， OR) 同样提供U LS试剂和试剂盒。 丨 用 任 何 U LS化合物进行标记的模板大小必须小于lOOObp。大 于 IOOObp的 模板通常会产生大量的点状背景。 PCR产 物 一 般 小 于 lOOObp，因此可直接进行. 标记。下 面 将 要 阐 述 的 两 种 D N A 破碎方法—超 声 破 碎 和 酶 切 均 可 以 用 于 Kreatech 和 Molecular Probes 的操作步骤 〇 Molecular Probes 用 Alexa—ULS 拭剂 时推荐用另一 DNA酶 I 操作程序。操作步骤和相应的试剂是Molecular Probes 提 供 的 U LS标记试剂盒的一部分。 3. 5. I DNA 破 碎 3. 5 . 1 . 1 超声破碎 1 . 用 T E 制 备 DNA溶 液 （20ng/ V L)，最好用至少IOOi^L DNA溶液进行超 声破碎。 2 . 将样品放在冰上，用 一 个 小 的 锥 形 底 塑 料 管 进 行 3 个 循 环 、每次循环 Im in 的超声破碎DNA。选择超声破碎仪的功率水平和工作循环数，尽量使用最 高的功率、尽量少的空泡形成。在破碎前和每个循环之后均将DNA溶液放在冰 上 Im in预冷。在第二个和第三个循环前用微型离心机的最高转速离心DNA溶 液 5s ，使全部溶液落至管底（见 注 释 14)。 3 . 取 部 分 D N A 溶 液 在 1 % 的琼脂糖凝胶上电泳确定DNA 大小是否合适。 电泳操作步骤参考本章3. 1 的步 骤 10〜14。 4 . 开始进行标记程序。 3. 5 . 1. 2 DNA 酶处理 1 . 制 备 D N A 酶 I 的储存液：用 ImL 5mmol/L 乙酸钠、 lmmol/L CaCl2、 5 0 % 甘 油 pH 5. 2 溶 解 Img D N A 酶 I (大 约 2000U/mg， Roche公 司 ， 目录号 104109)。在加冻干的D NA 酶之前和期间，缓冲液均放置在冰上。上下翻转溶 液直至完全混匀，不能振荡，储存液保存在一 2〇 °C条件下并尽量避免反复冻融。 2 . 用 IX 缺口平移缓冲液稀释DNA酶储存液，稀释比例为1 : 500 (见注释
    3. 在冰上将下列成分加到小离心管中： IjuL模 板 DNA、 2.5^xL IOX缺口平 移缓冲液、 3〜5juL稀释 的DNA酶 I ，加 水 至 25；^ 。 4 . 将上述小离心管置37°C温育、 lOmin。 5 . 将小离心管放在冰上终止反应。 6 . 在上述反应物中加入1/4体 积 的 10mm〇l/L 乙 酸 铵 和 2. 5 倍体积的无水 乙醇进行沉淀。 7 . 用适当体积的标记溶液重悬沉淀（见 本 章 3. 5. 2)。 8 . 取 部 分 DNA溶 液 在 1 % 的琼脂糖凝胶上电泳确定DNA 大小是否合适。 3. 5. 2 标记 15)。 3. 5. 2 .1 KREATECH推荐的操作程序 当 U LS试 剂 与 核 酸 以I : 1 比 例 （如 IU U LS试 剂 ： l Mg DNA) 混 合 ，可 获得合适的标记效率。当标记的核酸量不是标准的Ijug时 ，核 酸 与 U LS试剂的 比例必须保证1 : 1 。当标记的核酸量少时，应 该 至 少l 〇〇ng、 20y L 体积。另外， 标记较大的核酸量，不应超过2(V L 中 IOiUg核酸。只有模板浓度不低于5ng/VL 可以用较大体积进行标记， U L S 试剂量随着加入的模板量进行调整。如果模板 稀释度太大，可以不加标记溶液。 1 . 在 Ijug模板中加入IU (2斗 ）U LS试 剂 （见 注 释 1 6 和 17)。 2 . 用标记溶液将体积调至2(^L ，混勻。 3 . 在 65°C条件下温育15min。 4 . 稍离心。 5 . 用离心柱纯化探针。 3. 5. 2. 2 Molecular Probes公司推荐的操作程序 Molecular Probes公司提供应用U LS标记系统结合各种染料的试剂盒。该 试剂盒包括破碎DNA和标记探针所用的各种试剂。除了以下几项外，标记操作 择序和注意事项基本相同。 1 . 在标记前， Molecular Probes的 U LS染料试剂依据选择的染料溶于不同 的缓冲液中。有一个图表提供了与各个染料相关的所有特定信息。 2 . 标记前， DNA在 95°C 变 性 5min，然后在冰上快速冷却。请 注 意 ：变性 不是必需的步骤，但可以提高标记效率2 0 % 〜4 0 % 。 3 . 标记反应物体积是25； xL。 4 . 在 80°C温育 15min。 5. Molecular Probes声 明 ：由于该公司U LS试剂结合的自有染料的特异性， 对 以 前 Kreatech提供的操作步骤已经做了修改。

    六、间接检测的标记蛋白

    通过将荧光基团与蛋白质（如抗生物素蛋白、链霉亲和素或抗体蛋白）结合 制备间接标记FISH 探针的辅助检测试剂。许多种类的由荧光基团标记的抗生物 素 和 抗 体 已 商 品 化 （如 Accurate Chemical and Scientific Co. ， Westbury， NY; Calbiochem， San Diego, CA; Cappel Organon Teknika， Durham, NC; DAKO Corp. ， Carpinteria， CA; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA ； Kirkegaard and Perry Laboratories, West Grove, PA ; Molecular Probes， Inc. ， Eugene, OR; Pierce Chemical Co. ， Rockford， IL； Sigma Chemical Co. ， S t Louis， MO) 标记的蛋白质在实验室制备也相当容易。未标记的抗生物素和 其他抗体均可从上述所列公司获得。 作为辅助检测试剂，选择链霉亲和素多于抗生物素，因为其等电点接近中性 pH ，一般认为可以降低非特异性结合。同样，当整个抗体用于F IS H 时 ，常常 去掉较为疏水的F c 区以降低非特异结合。 F c 区可以通过木瓜蛋白酶消化从抗体 中的抗原结合簇切除，产 生 F ab 颗 粒 （单个结合臂） ，也可以通过胰蛋白酶产生 仍相连接的两个结合臂F (ab')2。 Fab'颗粒可以从F (ab')2 中制备，只是选择性 减少连接两个结合臂的二硫键。制 备 F (aV )2、 F ab 和 Fal/ 抗体片段的方法可以 从文献中找到[48’ 49]。 1 . 用 pH 8. 5〜9. 3 的 50m m ol/L硼酸稀释蛋白质至终浓度为1〜10mg/mL。 2 . 用 DMS0 、二甲基甲酰胺或丙酮溶解要求的荧光基团的N -羟琥珀酸酯衍 生 物 ，终浓度为20mmol/L 。 3 . 在蛋白质溶液中加入足够体积的荧光基团溶液，使荧光基团比蛋白质摩 尔 数 多 1〜2 0 倍 （见 注 释 1 8 和 19)。 4 . 将反应物在室温条件下轻柔摇动2h 进行反应。 5 . 利用 TBS或 PBS平衡和洗脱的SephadexG ^h型离心柱，用凝胶渗透层 析方法将蛋白质和未结合的荧光基团进行分离。标记的蛋白质洗脱在已占体积内 (见注释20)。 6 . 将标记蛋白质保存于4°0备用（见 注释21)

    七、标记探针的特征性指数

    为了准确计算探针浓度，应 有 足 够 的DNA、溶液体积应大于荧光光度计比 色杯中所需溶液的最小量而获得的吸光度值至少约〇.〇 5。常规测定吸光度值的 分光光度计比色杯通径长度为1cm，需要溶液的最小体界是几百微升（半微量比 色杯） 。有 关 DNA测定的专用分光光度计可以用约IO^L 体积的比色杯。下面的

    ​

    注意事项

    1 . 荧光基团如果长时间暴露于光线下就发生光漂白。荧光基团标记的DNA 或 标 记 的 dU TP可较短时间暴露于光线下，但避免超过实验准备的时间。 2 . 如果在电泳前去除未掺入的核苷酸，更容易确定DNA 片段的大小范围。 3 . 在乙醇沉淀后，一般用肉眼可见的红色或橙色荧光标记的DNA沉淀，而 那些用绿色荧光标记的DNA沉淀显示白色或浅绿色。
    4 . 每 IOjuL FISH 探针混合物中含50〜IOOng红色或橙色标记的单一序列探 针 ， 200〜400n g 绿色荧光标记的探针可以在多数种类的样品中产生足够亮的 信号。 5 . 为了获得较好的结果，模 板 DNA应为线性的，最好用六碱基识别位点的 限制性内切核酸酶消化，酚/氯仿抽提后用乙醇沉淀。 6 . 最初 的DNA含量范围为IOng〜3哗 。 7 . 在 37°C条件下标记时间范围从I h 到过夜。每一种标记应预先确定最适条 件 。 8 . 在 PCR操作中污染是非常严重的问题。为 了 避 免 PC R 反应的污染，尽 量用最好质量的试剂，这 些 试 剂 仅 用 于 PCR。所 有 溶 液 最 好 分 装 ，并冻存于 一20°C备用。同时，用防气溶胶的管尖移液以减少交叉感染。指定实验室中一个 区域专门用于PC R 操作。如果可能， DNA 样品的制备在单独实验室进行。另 外 ，每 次 PCR实验操作选择合适的阴性对照（无靶序列）是非常重要的。 9 . 特定靶序列的PCR需 要 对 T aq 酶进行滴度测定。过多的酶可导致非特异 性背景。 10. 改变循环数目以确定获得最好信噪比的合适循环数。 11. 大分子质量DNA (电泳时可见从胶孔到约2. Okb大小的成片条带）的 存在表明标记的探针不合适。这种探针可导致非特异性、非细胞成分的髙背景， 有时可以通过超声破碎降低背景。如 注 释 9 中提到的T aq 酶滴定方式，确定合 适 的 PCR循环数。 12. 除非 已 知DNA 可溶于较高比例的溶液中，有机溶剂与含水缓冲液的比 例不应超过1 : 4 。 13. 作为胶渗透层析的替代方法，未结合的荧光基团可以通过在储存缓冲液 (如 TE) 中透析从蛋白质中分离出来。每隔几个小时更换缓冲液直至未结合的 荧 光 基 团 完 全 去 除 （两次或更多次换液)。 14. 超声破碎时，样品体积、装样品的容器种类、超声破碎的时间和循环 数 、超声破碎仪功率水平和工作循环均依据超声破碎仪生产厂家、型号和探针而 不同。为获得大小合适的核酸片段有时需要进行一些预实验。 15. 进 行 DNA 酶 I 消化时，所有的试剂均应放在冰上。用前临时配制溶液。 16. DNA在标记前应进行纯化，去除蛋白质、 RN A 和游离核苷酸。 17. 应尽量避免高浓度Tris ( > 4 0 mmol/L) 或 E D T A (〉5mmol/L)、乙酸 镁 （> 1 0 0 m m d/L )、 NaCl (>100mmol/L) 和限制性内切核酸酶消化缓冲液， 因为这些对标记反应有限速效应。 18. 活化荧光基团与蛋白质的超额摩尔数和蛋白质浓度决定蛋白质标记的程 度 。用标记蛋白质试剂进行最佳标记所需的标记率决定于所用的荧光基团和蛋白 质的种类，并通过预实验确定。标记率太低导致荧光信号弱，标记率太高抑制特 • 38 •
    异性蛋白质结合反应，增加非特异性结合。 19. 蛋白质中加入的20mmol/L 荧光基团不应将有机溶剂浓度超过反应体系 体 积 的 2 0 % ，以防止蛋白质变性。 20. 作为凝胶渗透层析的替代方法，在 TBS或 P B S 中通过透析将未结合的 荧光基团从蛋白质中分离出来。每隔几个小时更换缓冲液直至缓冲液不再显示染 料颜色。 21. 在文献中有大量其他标记蛋白质的操作程序，也可从标记试剂提供商得 到 [例 如 ，见 Molecular Probes公 司 的 “胺活化探针”信息资料或Research Organics (Cleveland， OH) 公司提供的 “用荧光基团标记蛋白质操作程序”] 。

    来源：丁香实验

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