用 H e l i o s 基因枪递送基因

用 H e l i o s 基因枪递送基因

材料

试剂
麻醉齐 ([ 甲 苯 噻 嗪（xylazine) lm g /m l 和（或）氯 胺 酮（ketam ine) 10m g/m l]

实 验 动 物（通 常 约 20 g 重 的 小 鼠 ）

C aC l2 (I.0mol/L )

0,22um 滤器过滤除菌，室温保存。

乙 醇（100% 无水乙醇； Sp e c t r u m)

为避免吸水，不用的时候一定要旋紧瓶盖。

表 达 目 的 基 因 的 质 粒

需要的情况下，用空载体质粒作为空白对照。用 标 准 方 法 扩 增 质 粒（ SatnbrookandRussell2001), 并 用 商 业 试 剂 盒 纯 化（如 Q uantum Prep 或 A urutn 柱 ，伯乐公司产品）。 T E 液重悬
质 粒 到 0. 5〜2 mg/ml。

亚 精 胺（50m m ol/L , 自 由 碱 ；Sigm a-A ld rich )

将 I g 亚 精 胺 溶 于 6.8m l 无 菌 Milli-Q 水 中 ， 0 . 2 2um滤 膜过滤除菌，制 成 lmol/L 的储液，分装于一 70℃ 保 存 。用 Milli-Q 水 按 1 : 2 0 稀释储液到 50 mm 〇 i/L 工作液， - 7 CTC 保 存 。

仪器

分 析 天 平

电动剃毛刀

Helios 基因枪系统（Bio-R a d 实验室）

该系统包括 HeIios 基因枪、样品管固定器、垫圈和 O 环、 9 伏电池、样品管提取工具、特殊的氦气阀和调节器、样品管制备站、氮气阀、带硅橡胶转接管的 IOml 注射器、镀金管(Tefzel) 管、 1.0um 和 1 . 6 um的金颗粒、样品管切割仪、聚乙烯吡略酮，干燥剂、样品管储器。

压 缩 氦 气（4. 5 级）

压 缩 氮 气（4.8 级)，带 1〜3psi 调节器。

恒 流 泵（可选）

带 25 号半英寸长针头的 I m l 注射器

超声水浴

方法

制备包覆 DNA 的金颗粒以下描述制备包覆 D N A 金颗粒的方法，这些金颗粒足够填充一个长样品管，通常可以切割成 40〜4 5 个半英寸长的样品管（步骤 21〜23)。

1•在 1.5m l 的离心管中加人 25m g 金颗粒。如需要制备对照样品管，另外称取 25m g 样品，置于另一个 1.5m l 的离心管。除了加入质粒外，两个样品平行处理。

实验中为了检验目的基因的背景水平，可以制备不含 D N A 的金颗粒，也可以制备包覆不表达目的基因的空载体的金颗粒，作为对照。重复步骤 12〜16, 将这些金颗粒装人另一个 Tefzel 中。

2 . 向每个离心管中加人 IOOfxm 50m m o l / L 的亚精胺溶液。

3 . 将金颗粒和亚精胺的混合物涡旋混匀几秒，然后超声水浴中超声处理 3〜5s 以得到分散完全的金颗粒。

4 . 向上述金颗粒溶液中加入 50um 1 ug 每微米的质粒，使 D N A 的载药率为 2，同时恰当制备对照载体。

5 . 高速涡旋 D N A 和金颗粒，大 约 5s。

6•以适度速率润旋的同时，小心地打开离心管盖，将 IOOuI l m o l/L 的 CaCl2 溶液缓慢滴加到混合物中。盖上离心管盖并高速涡旋 5s。

7•将金颗粒载体室温下静置 l O m i n。

8 . 将金颗粒载体离心 15s , 弃上清。

9•轻微涡旋离心管，使得沉淀在剩余的溶液中重悬。

10•向离心管中加入 I m l 1 0 0 % 乙醇。离 心 5s, 弃上清，并重复 2 次。

1 1 . 轻微祸旋离心管，使得沉淀在剩余的溶液中重悬。将其转移到一个 15m l 带盖的聚丙烯离心管中。用 200ul 100% 乙 醇 清 洗 1.5m l 离 心 管 2 次 ，合 并 到 15m l 离心管中。

12.向上述 15m l 离心管中加人 2.6m l 1 0 0 % 乙醇，并立刻用这种悬液准备样品管。

将 DNA 金颗粒载体悬液转载到样品管

13•用氮气吹 T e f zeI 管使之完全干燥。将没剪切过的 TefzeI 管通过管支撑环，从左侧远端 的 O 环插人到样品管制备站的右边。打开压缩氮气调节压力到 1〜3p Si，然后用流速计上的调节旋钮调节流速到 0• 5L /m i n ，通 气 15 min。

1 4 . 将 带 1 8 英尺长的硅橡胶转接管的 I O m l 注射器装人到注射器套筒，然后将其固定在样品管制备站底部的注射器支架。将 Tefzel 管从样品管制备站上移走。用流速计上的调节旋钮关掉氮气。

如 果 用 蠕 动 泵 去 除 Tefzel 管 中 的 乙 醇 ，要 先 用 乙 醇 将 蠕 动 泵 的 速 度 设 定 在 3.6〜7.2 ml/min。用硅橡胶转接管将泵和 Tefzel 管连接起来。移除乙醇的速度越慢， Tefzel 管中’的乙醇将被移除的越多。

15•用切刀切割 30in (75c m ) 长的 Tefzel 管（对照也需要相同的长度）。保 证 30i n 长的样品管两端都没有扭曲变形。将 30i n 长的样品管的一端与连有 I O m l 注射器的硅橡胶转接管相连。连接之前要将注射器芯完全推到底。

16.涡旋金颗粒载体悬液（如果需要，可以进行超声处理得到均一的悬液）。倒转装有金颗粒载体的离心管数次重悬金颗粒，旋开管盖，将样品管的自由端插入，然后用另一端的注射器快速地将金颗粒载体悬液吸入到样品管中（大 约 2in， 58c m 深） 。

在将金颗粒载体悬液吸入样品管中的时候不要涡旋。不要尝试将离心管中的乙醇全部吸干。

特别注意：不要吸入气泡。

I7•从离心管中拿出样品管，放平，继续将悬液吸人样品管内 2〜3in。立刻将装载金颗粒的样品管，连同注射器装到样品管制备站上的正确位置。

18•静置 3〜5m i n 。将样品管从硅橡胶连接管上拔出，然后连接到已经固定在样品管制备站底部的 I O m l 注射器的硅橡胶连接管上。用注射器将乙醇以〇.5〜lin/s 的速率抽 除（大概需要 30〜60s)。

如果使用蠕动栗，将调好流速的泵接到样品管上。这样就没有必要在注射器固定器上放置IOmI 注射器。

19•从样品管拔除注射器及硅橡胶连接管。立刻将样品管制备站中的样品管旋转 18 〇°。3〜4s 后打开样品管制备站电源旋转样品管。

20.旋转样品管 20〜30s 后 ，打开氮气流量计上的控制阀，在样品管转动的情况下，用流速为 0 •35〜0. 4L /m i n 的氮气吹干样品管。此过程持续 3〜5m i n 后关闭样品管制备站马达开关。关闭氮气流量控制阀，移走样品管。

准 备 H e l i o s 基因枪的样品管

21•检查样品管，确定金颗粒载体是否均匀分布。用记号笔在管子上金颗粒不均匀分布的地方做好标记。

不均匀分布通常仅限于金颗粒沉降外侧的 2in 内，但有时也会在样品管内发现。理想情况下 ，颗粒应该均一分布在样品管内部的表面；然 而 ，在氮气吹干的时候有可能将颗粒吹到样品管的一端。但只要肉眼判断每〇.5in 长的样品管包含相同量的金颗粒，就可以用来准备基因枪的样品管。

22.用剪刀将不均匀的部分剪掉。用样品管切割仪将剩余部分切割成〇.5i n 的小段。

2 3 . 将样品管储存在装有干燥剂的样品管储藏罐中。盖紧瓶盖，做好标记，用封口膜封好后储存在 4°C 。

在上述条件下，样品管可以储存一年。

用 H e l i o s 基因枪转运颗粒

这种基因枪可以用来在体内转运 D N A 到多种细胞，然而，转 运 D N A 到表皮细胞最容易。通过调节氦气压力，可以将大部分颗粒递送到角质层下的表皮细胞，而不穿透真皮组织。

2 4 . 为了活化 Helios 基因枪来转运基因，要向基因枪中装人电池和金属垫圈。将氦气软管的一个末端连接在 Helios 基因枪上，另一端连接在氦气控制阀。打开氦气瓶的总阀，调节氦气调节器至合适的压力。

以将基因转运到老鼠皮肤为例，使 用 1.0〜 1.6um 的 金 颗 粒 时 ， 350p s i 的压力通常较为合适。

2 5 . 在基因枪上装上一个空样品管架，打一到两枪以对系统增压。从基因枪中移去空样品管架。

26.步骤 21〜23 中准备好的样品管装载在样品管架中。将这个样品管架插人到基因枪中。

动物的基因转运

27•依据 I A C U C 操作选择合适的麻醉剂注射到动物体内，以麻醉动物。

推 荐 注 射 200ul 甲 苯 噻 嗪（lmg/ml) 和 氯 胺 酮 （lOmg/ml) 的混合物到 2 〇 g 重的小鼠腹腔。

28.将动物目标区域的毛剃净，通常是胸部和腹部，然后刷一下。耳背也是一个很好的位点，并且不需要剃毛。

29.将基因枪放在靶位点并且开火。

30.在适当时间后，用合适的分析方法分析转人的基因是否表达