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    基本方案 辅助病毒缺陷复制子储存液的制备

    相关实验：应用辅助病毒缺陷 HSV-I 扩增载体进行基因传递实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    杜氏改良培养基 G415 0.25%胰蛋白酶 0.02%EDTA 去血清培养基 PBS 漂白剂
    组织培养瓶 加湿培养箱 直径组织培养皿 锥底离心管 干冰 乙醇浴 Probe超声仪 针式过滤器 —次性注射器 离心管

    步骤

    1 . 在 D M E M / 1 0 % F B S (含 5 0 ( V g / m l G 4 1 8 ) 中培养2-2细胞。每周传代两次，每次 取 约 1/5新鲜培养基（ 2 0 m D 到新的75cm2 组织培养瓶。 2 . 转染前一天，除去培养基， P B S 清洗培养板两次，然后加一薄层胰蛋白酶/ E D T A ， 37°C孵 育 IOmin使细胞从培养板上脱离。血球计数板进行细胞计数（ 附 录 31) 后接 种 I. 2 X 1 0 6 个细胞到6 0 m m 培养皿中，力 D 3ml D M E M / 1 0 % F B S 。 3 . 每个需要转染的6 0 m m 培养皿，加 IOOjLd Opti-MEM I 去血清培养基到每个15ml离心管 中。其中一个15ml离心管，力 〇 2jug PacHl切的cos质粒混合物（5 种克隆，每种〇.4pg; 支持方案1 ) 和 0.6鸿复制子D N A 。另一个离心管，加入12一LipofectAMINEo 4 . 汇集两个管子中的物质，混 匀 （ 不能振荡） ，室温孵育45min。 5 . 取 2ml Opti-MEM I 清洗前一天得到的培养物（ 第 2 步） 。加 I. Iml Opti-MEM I 到 第 4 步 制 备 好 的 含 有 D N A - L i p o f e c t A M I N E 转 染 混 合 液 的 管 子 中 （ 总体积 1.3ml)。吸去培养基（ 细胞为100%汇合） ，加转染混合液，孵 育 5. 5h。 6 . 吸去转染混合液， 2ml O p t i - M E M I 清洗细胞3 次，加 3. 5ml D M E M / 6 % F B S 孵 育2〜3d。 转 染 2 d 后 ， 至 少 5 0 % 的 细 胞 应 该 成 病 理 症 状 （ 细 胞 变 圆 但 仍 然 贴 壁 ） 。在 包 装 实 验 中 ，表 达 G F P 基 因 的 复 制 乎 载 体 的 应 用 可 以 方 便 的 检 测 转 染 效 率 和 迁 移 。 7 . 用细胞刮棒将细胞刮到培养基中，转移悬液到 1 5 m l 离心管中，用干冰/乙醇浴和 37°C水浴反复冻融3 次。 8•将含有细胞的离心管放置在装有冰水混合物的烧杯中，把超声探针浸入细胞悬液液 面 0 . 5 c m 处 ， 2 0 % 输出功率处理20s。
    9. 1400g ， 4°C ，离 心 IOmin后除去细胞碎片， 0.45p m 针式过滤器接在20m l —次性注 射器上过滤上清到新的15m l 离心管。取一部分样本做滴度测试（ 支持方案2)，然后 分离剩余的原种分成I m l 的等份，在干冰/乙醇池中冻存，储存于一80°C (至少6 个 月） 。在保存前浓缩（ 第 IOa和 Ila步）或纯化和浓缩（ 第 IOb〜13b 步）原种。 离心沉淀 IOa. 将 第 9 步中的载体溶液转至一 30m l 离心管， 4°C ， 20 OOOg•离心2h 。 11a. 用 小 体 积 （ 如 300^1)的 1 0 % 的蔗糖溶液重悬沉淀。取出一份原种测滴度（ 支持方 案 2)，然后等量分装（ 如 3〇4)，冻存于干冰/乙醇池。储存于一80°C (至少6 个 月） 。 用不连续的蔗糖梯度纯化和浓缩 IOb. 在 Beckman Ultra-Clear 25m m X 89m m 的离心管将如下溶液在管中分层，准备鹿 糖梯度： 7ml 60% 簾糖； 7ml 30% 蔗糖； 3ml 1 0 % 蔗 糖 （ 上层） 。 lib. 小心地将第9 步中的载体原液加入梯度上面， 4°C ， 10 O O O g 离 心 2h。 12b. 从上面吸去1 0 % 和 3 0 % 的蔗糖层，在 3 0 % 和 6 0 % 蔗糖层之间的表面收集病毒。 转移至广 Beckman Ultra-Clear 14m m X 95m m 的离心管，力口入约 15ml 的 P B S ， 4°C ， 10 〇〇〇 g 离 心 I h 以沉淀病毒颗粒。 用 纤 维 可 视 镜 观 察 时 ， 3 0 % 和 6 0 % 蔗 糖 层 之 间 的 表 面 可 见 雾 状 带 。 13b, 用 小 体 积 （ 如 3 ( % 1 ) 的 1 0 % 的蔗糖溶液重悬沉淀，等 量 分 装 （ 如 30juD。冻存于 干冰/乙醇池。储存于一80°C (可保持稳定至少6 个月） 。冻存前，保留一份原液 测 定 滴 度 （ 支持方案2)。 支 持 方 案 1 制 备 用 于 转 染 的 HSV-I 黏 粒 DNA 黏粒克隆保存于一8〇°C 添加了 7 % 的 D M S O 的 S O B 培养基中。 材 料 （ 标V 的条目参见附录1) H S V - I 黏性系列C 6Aa48A a 大肠杆菌克隆，包括黏性6A a ，黏 性 1 4 , 黏 性 2 8 , 黏 性 48A a ，黏性 56 (图 12. 8. 1) V 含 5〇|ug/m l 氨苄青霉素的S O B 培 养 基 （ S O B /a m p ) D M S O PlasmidMaxiKit (Qiagen)，包括 Qiagen-tip 500 柱 ，溶液 P l 、 P 2、 P 3、 Q B T 、 Q C 和 Q F (溶液Q F 提前预热至65°C ) 异丙醇 70% (V /V ) 乙醇 ■ VTE 溶液， p H 7. 5 、 限制性内切核酸酶Dra I 、 1 和 Pac I 高分子质量的D N A 标 准 品 （Life Technologies)
    Ikb D N A ladder (Life Technologies) 电泳用的琼脂糖 V T A E 电泳缓冲液 l m g / m l 溴化乙键 八25 : 24 : I (W V /V ) 苯酚/氯仿/异戊醇 25 : I (V /V ) 氯仿/异戊醇 1 0 0 % 乙醇 V 3mol/L 乙酸钠， p H 5. 5 I 7 I n m X l O O m m 无菌的带螺旋帽的管（ 如 F a l c o n 2 〇 5 9 ) SorvaU G S A 和 SS-34 转子 65°C和 37°C水浴箱 250m l 的高速离心管 30m l 离心管 1. 对 于 H S V -I 黏 性 克 隆 系 列 C 6Aa48A a 的每个黏性克隆，准 备 一 含 有 5m l 无菌的 SOB/a m p 培养基的17m m X 100m m 无菌的带螺旋帽的管。用接种环接种长期冻存的 合适的黏性克隆。在 37°C 摇床中孵育8h。 2. 各转移Iml至一含有300m l 无菌S〇 B/a m p 培养基的2L 烧瓶中，在 37°C 摇床中再孵 育 12〜16h。 常 常 在 白 天 预 先 培 养 5m l ， 扩 大 培 养 过 夜 。 不 要 超 过 规 定 的 將 育 次 数 。 因 为 这 样 会 增 加 黏 粒 变 形 的 风 险 。 同 样 的 原 因 ，避 免 菌 落 去 除 克 隆 。 3. 将菌液等分成I m l 置于低温冻存管，每 管 加 人 7OfjJ D M S O 。混匀并长期保存于 一80°C (可保存数年） 。 4 . 将余下的菌液在2 5 0 m l 的高速离心管中离心沉淀， 4°C ， 4 0 0 0 g 离 心 l O m i n 。 5•倒去培养基并将离心管倒置于纸上1〜2m i n 以吸干所有的液体。用 15ml P l 重悬沉 淀后加入15ml P 2。旋 转 6 次混匀，并在室温下孵育5min。 6. 加 入 15ml P 3 , 立即旋转6 次混匀。将管子至于冰上孵育20min，再次旋转离心管。 4°C ， 16 OOOg 离心 30min。 7 . 同时，将 5 个 Qiagen-tip5 0 0 的柱子分别用10ml Q B T 平衡。在重力下流干液体。在 柱上标记克隆名，并用一小片Kimwipe膜包住。 8. 将 第 6 步中的上清小心地从膜中过滤至Qiagen-tip500的柱中，在重力下使液体通过 树脂。 9. 用 30m l 的 Q C 洗柱2 次 ，然后用15m l 预 热 （65°C ) 的 Q F 洗 脱 D N A ，液体置于一 30m l 离心管。 10. 用 0. 7 倍体积10. 5m i 的异丙醇沉淀D N A ，立即以20 000g ， 4°C 离 心 10min。 11. 小心移去第10步中的上清且不弄坏沉淀，在管壁外标记沉淀位置。用冷却的70% 的乙醇洗涤沉淀，必要的话按照第10步的方法再次沉淀。 12. 完全吸去上清，但是避免沉淀过干。用20〇4 T E (p H 7. 5 ) 重悬沉淀，将 D N A 溶 液转移至一小离心管，保存于4°C 。鉴定D N A 后 ， （ 测定浓度和限制性内切核酸酶 酶切分析，第 13〜I4 步） ，分装成1〇〜5Ojug保存于一2〇°C 。
    13.用紫外分光光度计测定第12步中的D N A 溶液在260n m (A 26。）和 280n m (A 280) 处的吸光值。 在A 26。处的值I.O 相当于双链D N A 50jug/mlD 同时在A 26。和A 280的比率可表明 D N A 的纯度。比较纯的D N A 样品在A mo/A 28。的值为1.8，不要使用低于这一比率 的D N A 样品。 14•同时可进行的反应，取 第 12步所得的黏性D N A 2jug用限制性内切核酸酶Dra I ， I 各 I O U 在 37°C 酶切2h。在 T A E 电泳液中以40V 的电压， 〇.4% 的琼脂糖胶 电泳过夜以分离片段。用髙分子质量的D N A 和 Ikb D N A marker作为分子大小标 准。用溴化乙锭染色，如 图 12. 8. 2 所示来比较酶切片段类型。 （0 . 4 % 的胶很软应 小心处理)。 15. 将 5 种黏性D N A 各 IOjLig组合在一小專心管中，用限制性内切核酸酶p>aci 50U 配成总体积为IOCyl在 37°C酶切3h。 用高分子质量的D N A 和 Ikb D N A marker作 为分子大小标准。通 过 0 . 4 % 的琼脂糖胶电泳1〜2^1反应混合物证实酶切完全（ 图 1 2. 8. 2)。 H S V -I 在黏性D N A 中的插入片段在唯一的P acX 限制酶切位点侧面。用 P ac 工酶切可以从黏性D N A 的 骨 架 （ 约 7kb) 中释放H S V -I 插 入 片 段 （35〜40kb)， 它可使克隆间的同源染色体在转染时更容易重组。 16. 抽提反应混合物，首先用IOOjuI (1体积）25 : 24 : I (V /V /V ) 的苯酚/氯仿/异戊 醇，然后用l〇〇 /xl (1体积）24: I (V /V ) 的氯仿/异戊醇。加 人 25(^1 (2. 5 体积） 1 0 0 % 乙醇和IOjlJ (0. 1 体积）的 3mol/L 的乙酸钠（ p H 5. 5 ) 沉淀D N A ，一20°C 孵 育过夜。不要振荡，可用手指轻弹混匀以避免破坏大的D N A 片段。 重要提示：由于D N A 将转染至哺乳动物细胞（ 基本方案） ，在无菌条件下处理 以下操作。 室温下将管子以20 OOOg的速率离心IOmin, 小心弃去上清液，用 7 0 % 的乙醇洗涤 一遍。倒出乙醇，沉淀干燥lmin，用 IOOjlJ T E (p H 7. 5 ) 重 悬 （ 用最小的移液枪） 沉淀。 18.按照第13步测量D N A 浓度。分装成IOjug保存于一2〇°C 备用。 支 持 方 案 2 扩 增 子 的 滴 定 提示：滴度与每毫升的转录单位数（t.u./ml) 是相关的。且不影响每毫升中的感 染载体颗粒数。与转染效率相关的因素是： ①用于扩增的细胞数，②调解外源基因表达 的启动子，③外源基因和④检测方法的敏感性。 材 料 （ 标" V 的条目参见附录1) Vero (clone 76； E C A C C # 85020205), BFIK (clone 21； E C A C C ^ 85011433), 或 293 (ATCC #1573)细胞 DMEM (Life Technologies)添加 10%和 2% FBS (DMEM/10%FBS 和 DMEM/ 2%FBS)

    P B S 从载体中收集来的样本（ 基本方案，第 9, Ila或 13b 步） 7 4 % (m /V ) 多聚甲醛溶液， PH 7.〇 V X -gal染色液， G S T 溶液或合适的一抗、二抗 24孔组织培养板 潮湿的37°C， 5 % C O 2 培养箱 倒置荧光显微镜 倒置光学显微镜 1. 将 细 胞 （ 如 Vero76、 BHK 2 1 或 293细胞）按 照 I .OXlO5 的密度接种于2 4 孔板， 加 入 0. 5ml DMEM/10%FBS。孵育过夜。 2 . 吸去培养基，每孔均用P B S 洗 ，加 入 0.1^x1， Ijul或 5 4 载体中收集来的样本，在 250jlJ D M E M /2% F B S 中稀释。 3. 孵 育 1〜2d ，移去接种物。用 4 % 的 多 聚 甲 醛 （ pH?. 0) 250p l 固定细胞。用 PB S洗 涤固定的细胞2 或 3 次 ，然后按照检测操作方案根据转入的外源基因观察类似绿色 荧 光 （ 第 4a 步） ， X-gal染 色 （ 第 4b 步）或免疫细胞化学染色（ 第 4c〜6c 步） 。 检 测 绿 色 荧 光 基 因 的 表 达 （ G F P ) 4a. 用倒置荧光显微镜观察第3 步 （ 固定前后）中的细胞。数含绿色荧光细胞的个数， 通过乘以外源基因表达细胞数和稀释倍数来确定载体的滴度。 检 测 表 达 大 肠 杆 菌 IacZ基因的细胞 4b•在第3 步中的24孔板中每孔加人250]LaX-gal，在 37°C下孵育4〜12h (取决于细胞 类型和调节外源基因的表达的启动子） 。 5b. 用 P B S 洗涤细胞3 次终止染色反应。用倒置光学显微镜数蓝色细胞数，通过乘以外 源基因表达细胞数和稀释倍数来确定载体的滴度。 通 过 免 疫 细 胞 化 学 染 色 的 方 法 检 测 表 达 外 源 基 因 的 细 胞 4c. 在 第 3 步中的24 孔板中每孔加入250/xlGST溶 液 （ 封闭非特异性结合位点和per_ meabilize细胞膜） ， 室温下静置3〇 min。 加 含 一抗的封闭液（ 用 G S T 溶液稀释） ， 4°C孵育过夜。 一抗可选的稀释范围由经验决定，一般为1/100〜]y l0000。 5c. 用 PBS洗涤细胞3 次 ，每次洗IOmin。加 人 二 抗 （ 用 G S T 溶液稀释） ，室温下孵育 至少4h 。 6c. 用 P B S 洗涤细胞2 次 ，根据合适的显影操作规程显影。在倒置光学显微镜下数外 源基因表达的细胞数，通过乘以外源基因表达细胞数和稀释倍数来确定载体的 滴度。 结合的二抗是商业化的。有关可选的稀释倍数和显影操作规程（ 取决于结合反 应）由抗体公司提供。

    来源：丁香实验

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