S V 4 0 体 外 传 递 系 统

S V 4 0 体 外 传 递 系 统

材料

试剂

A T P (10 0 m m o l/ L ；R oche)

缓冲液 I

10 m m o l/L H E P E S (p H 7. 9)

10 m m o l/L K C l

0.lm m o l/L E D T A

0 . 1 m m ol/L E G T A

用 0.22um 滤膜过滤灭菌。缓冲液 I 能在 4°C 保存 30d。

使用前加入：
0.5m m o l / L phenylmethylsulfonyl fluoride (P M S F )

l m m o l / L 二硫苏糖醇（D T T )

在 Iml PBS 中溶解 1 片蛋白酶抑制剂（ Roche 1873580 ) , 用缓冲液 I 1 :50 稀释。

缓冲液 II

20m m o l / L H E P E S ( p H 7. 9)

0.4m m o l / L NaCl

0.l m m o l / L E D T A

l m m o l / L E G T A

用 0.22um 滤膜过滤灭菌。缓冲液 II 能在 4℃ 保存 30d。

使用前加入：

l m m o l / L P M S F

l m m o l / L D T T

在 Iml PBS 中溶解 1 片蛋白酶抑制剂（ Roche 1873580 ) ，用缓冲液 11 :50 稀释

CaCl2 (10 mmol/L)

细胞

用于研究的细胞系

在培养皿或悬浮维持要转化的细胞系。

草 地 夜 蛾（Sf9 ) 细胞

培养基

细胞生长培养基（含有乳清蛋白和 yeastolate 的 G r a c e 昆虫培养液）

完全生成培养基

使用所研究细胞系合适的培养基。

M g C l 2 (200m m o l /L )

Nonidet P -40 (N P -40； 1 0% V /V in P B S )

磷酸盐缓冲液（P B S )

质粒 D N A (可达17. 7k b)

要获得最高体外包装效率，使 用 C s C l —氯化铯密度梯度平衡离心纯化质粒 D N A 。

小 干 扰 R N A (s i R N A )

V P l 杆状病毒

通过引人一’个 DNA 片段（SV40 上 1463^〜2770) 到由 Aw 吨 ra 灿 a cW/omicanuclear pholyhedrosis 病毒（AcMNPV) 衍生（Luckow and Summers 1988) 的 pVL1393 质粒（PharMingen， San Diego, California) 中，进行 VPl 的克隆（PharMingen， San Diego,
California) 。然后经限制性内切核酸酶 SmaI 和 BgZII (Sandalon and Opperiheim 1997,2001) 消化。分装病毒储液，保存在一 80°C 中。

仪器

培 养 箱（恒湿， 37°C ， 5 % C O 2)

离 心 管（40m l ，无菌， Sorvall)

微 型离心管（1.5m l )

摇床

搅拌培养瓶（250m l )

组织培养皿（60m m )

有微型离心管平台的涡旋混合器

恒 温水浴锅 （37°C )

方法

转化 Sf9 细胞

1.在 250m l 培养瓶中，以感染复数为 1 0 的 V P l 杆状病毒感染新鲜培养的 5 X 1 〇⁸ Sf9细胞。

不建议放大到 500 ml。

核蛋白提取

感 染 后 4〜5d 收 集 Sf9 细胞。收获细胞的时间由 vpl 的表达水平及核提取物的包装功能决定。

2•把转化后的细胞从 250m l 培养瓶转移到预冷的 40m l 试管中。

3•准备缓冲液 I 和 II。放置在冰上。预冷微型离心管。

4.用 冷 的 P B S 清洗细胞三次，每次在 4°C ， 6000r/m i n 离 心 5m i n 。

5•去上清。涡旋使沉淀完全重悬

这一步不要冷冻。

6•加入 I m l 缓冲液 I。轻轻吹打使沉淀重悬直到完全分散。

7.慢慢加人 28m l 缓冲液 I。在冰上孵育 15m i n 。

8•加人 2. 3m l 10% N P -40。涡旋混合 10s。

9•在冷冻离心机 （约 4°C ) 中 13 000r/m i n 离 心 3m i n 。

10.用连接真空吸气器的吸头去除上清。 、细胞核内物质在沉淀中。

11•涡旋振荡沉淀。加 人 5m l 缓冲液 II。充分混合后转移到微量离心管中。

每管的总体积本要超过 lml。

I2. 把管子放在连接到振荡器的平台上。 4°C 涡旋混合 15m i n 。

13.4 C ， 13 000r/m i n 离心微量离心管 5m i n 。

14•将核提取物上清分装到预冷的管子里。

15•测定核提取物的蛋白质浓度。

注意到核提取物含有 N P -4 〇。并不是所有测定蛋白质浓度的方法都和 N 1m o 兼容。只有当浓度起过 3m g /m l 才能用于体外包装。

16• 在 一 20〜一 8℃ 储存核提取物。