数据分析与处理以及数量评定

数据分析与处理以及数量评定

1.用 Affymetrix Gene Chip 软件进行最初的数据处理。通过检测图像像素值，此软件测定每种寡核苷酸探针的荧光强度从而计算出每种转录本的简化值。此简化值被称为「平均差异」，它通过确定某一特定转录本在所有引物对中的特异信号而得（即将某一特定转录本由完全匹配的寡核苷酸引物所产生的信号值减去其由不完全匹配的寡核苷酸引物所产生的信号值)。平均差异值与某一特定转录本在所有转录本中的比例呈正比。Gene Chip 软件还可进行质量评估，又成为「绝对结果」，从而判断某一特定转录本在样品中的有或无。

2.要比较某一基因在多种实验下的平均差异有必要标准化不同批次间的表达量。有几种方法可以进行。Gene Chip 软件提供了两种方法：「标准化」用于减少或消除相同实验设计但反应条件不同的数据差异，而「标度」将不同实验设计的平均差异调整至同一平均表达量。两种方法中，使用者都可以在同一张芯片上使用某种特定引物集或各种不同引物集。Gene Chip 软件以外的第三种方法是根据已知浓度的转录本（杂交控制池）杂交所产生的平均差异值绘制标准曲线。这种方法可以不考虑试验设计的不同将同一批次的所有数据标准化，并可将平均差异转换为绝对浓度（mRNA 的分子数)。转换时，阴性对照的平均差异被默认为零。将可检测到的最低表达量水平设置为低或零平均差异值以排除假阳性结果是明智的。根据杂交对照池中关于已知转录本的相关数据，预估可检测到的最低表达量。绝对浓度低于预估值的视为阴性结果。GeneChip 软件将低于背景值 4 倍的数据值视为阴性结果。

3.质量评估用于三大领域。

RNA 质量。商业化的基因芯片设计数据来自于公用数据库，3'-UTR 序列有时缺失。若探针位于 polyA+尾 1500 个碱基以前，即使使用高质量的 RNA，也可能产生假阴性结果。若 RNA 部分降解或有污染物阻碍反转录反应，假阴性率增加。通过检测芯片上高丰度的基因，如 P-actin 和甘油醛-3-磷酸脱氢酶，3'、中间和 5'探针所产生的转录本可评估 RNA 质量。当 W 与^转录本比值小于 0.5 时，假阴性率较高。

实验过程质量。从 RNA 样品中未标记 RNA 转录本的多少可监控 RNA 合成步骤的质量。合成对照池中各种成分的平均差异值应该与其在之中的相应浓度呈正比。此外，若在 GeneChip 软件中使用数据标准化，标准化后，使用相同引物集在不同批次中所产生的平均差异值应该相似，不应该出现结果的上下波动。



芯片性能。与 RNA 不完整一样，芯片性能不佳也能导致假阴性。标记的杂交对照池可指示每块芯片不同的灵敏度。这个对照池被广泛使用，其缺点在于低于 5.Opmol/L 时，它的指示能力不佳。为了大致确定检测范围，需要更多的对照转录本。或者采用标准曲线法标准化数据，每块芯片上所有基因的预计浓度将可与 GeneChip 提供的相应绝对结果进行配对，从而得出检测范围。