为转导靶向构建RG D- 修饰 纤 毛 的 A d 载体

为转导靶向构建RG D- 修饰 纤 毛 的 A d 载体

材料

为纤毛修饰构建穿梭质粒载体

1.从回收质粒分离抗-氨苄青霉素的纤毛区域片段。

a.EcoRI酶切10吨抗-氨苄青霉素的PAdEasy-I 质粒4 h。

b.1 % 琼脂糖胶回收9. 6kb DNA片段。

c. 连接环化。

合 成 的 新 质 粒（pFiberdE3- A m p ) 具备完整的纤毛区域。

2•分离抗-卡那霉素抗性基因。

a. EcoRI 酶切 IOfig pABS.4。

b•用K l e n o w 片段补齐酶切末端。

c. 用连接酶环化重组的质粒（pA B S .4A E c o R I )。

d•用 EcoRI 酶切 PA B S .4A E c o R I 。

e. 用 Klenow片段补齐B a w x H I 位点。

f•用 &出 1 酶切 PA B S .4A E c o R I 。

合 成 的 I.3k b 片段包含卡那抗性基因和末端两个SttaI位点。

3_将卡那抗性基因插人抗-氨苄纤毛载体。

a. 用 M /eT[酶切 pFiber-d E 3-A m p 。

b•用K l e n o w 片段补齐M fe 1 [位 点 。

c•用 BsiBI 酶切 pFiber-d E 3-A m p 。

d•将I.3k b 的 平 末 端 的 片 段 插 人 pFiber-dE3-Amp的M / el-BsiBI位点。

合成的载体（pFiber-dE3 ) 包括纤毛区域和氨苄抗性基因与卡那抗性基因。

构建突变的纤毛k n o b 基 因（图3)

4.P C R 制备互补的R G I > 4 C 片段。
a•加人30umol/L 的 primer A (上游引物）和 primer B (下游引物）到 500n g 的pFiber-d E 3 中，制 备 撤 eI-(R G I >4 C )。

b•加人30umol/L 的 primer C (上游引物）和 primer D (下游引物）到 500n g 的pFiber-d E 3 中，制 备（R G D ——4C )-M / e I 片段。

c•按如下条件设置 P C R : 94°C 变性 l O m i n， 35 个 循 环（94°C , 30s， 50°C ， 30s,72℃ , 60s), 72°C , IOmin

d. 用 2 % 的 琼 脂 糖 胶 回 收 NAeI-(RGI> 4 C ) (1199bp) 和（RG]>4C )-M/eI(180bp)。

5 . 制备突变的纤毛k n o b 序列。

a. 混合 M ieI-(R G I M C ) 和（R G I >4C )-M / e I 两个片段。

b. 不再加人引物 PCR 扩增 500n g 的混合物，条件如下： 94。 ( ：变性 4 min 30s , 10 个循 环（94°C ， 60s , 52°C ， 60s ， 72°C ， 4 min), 72°C ， 6 min。

c. 用 1 % 的琼脂糖胶回收 P C R 产 物（l352b p)。

12.用线性载体转染 293 细胞。

13.转 染 I d 后，将细胞接种人 96 孔板，用 含 SOOug/ml G 418 的培养基筛选，直到大约1/3 的细胞覆盖率。

14.适当扩增细胞，以用于后续的分析。

纯化 CAR/hEG F 融合蛋白

15.收集稳定表达 C A R /h E G F 的 293 细胞的培养基。

16.加人等体积的预冷硫酸铵，沉淀蛋白质。

1 7 . 离心收集沉淀，将之溶于原有体积 1 / 2 0 的 P B S 中。

18.用 P B S 透析。

19.用 T A L O N 含钴的金属亲合层析树脂（Clontech) 纯化重组蛋白。

20.用 P B S 透析。

21.通过 W e s t e r n 印迹检测表达的蛋白质。

22.检测接头蛋白和 A d 载体的靶向效率。

a. 将接头蛋白结合到 A d 载体上。

b . 研 究 E G F R -标记的 A d 转染表达 E G F R 的细胞的靶向效率。

转 录 耙 向 的 A d 载 体 构 建

材 料

试剂
A d E a s y 系 统（Qbiogene)

琼脂糖

菌株： B J5183 和 D H 5a

细胞株： 293 细胞

氯化铯

乙醇

甘油

卡 那 霉 素（25ug/m l )