通过重组 PCR 产 生 2A 连接的多顺反子可读框

通过重组 PCR 产 生 2A 连接的多顺反子可读框

材料

试剂

适合纯化D N A 的琼脂糖凝胶

煮 沸2〜3m i n 在 I X T A E 中溶解高纯度的琼脂糖。 55°C水浴直到温度平衡。加 3〜5M EB。胶凝后， I X T A E 充满容器，去掉梳子。超 过 500b p 片段的使用 1 % 琼脂糖胶。较小产物，琼脂糖浓度提高2% 。

克隆载体

有很多不同类型商业化载体编码不同选择可读框、抗生素抗性基因、荧光蛋白。重要的是确定所有载体系统检测不到2A 多 肽 介 导 的 「切割」，然后考虑克隆策略。

D N A 聚合酶和缓冲液

产物长度，模 板 中 G C 比例，引 物 Tm影响酶的选择。我 们 一 般 使 用Advantag^HF 2 PCR试 剂 盒（Clontech)，可以一致的产丰3k b 产物低的突变率。其 他 髙 忠 实 性 酶（八如£^昭^GC, Clontech; Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶， Finnzymes; 扩增长的模板， RocheApplied Science)，这些试剂都成功地在我们实验室使用，选择依赖于使用的模板和引物长度，根据操作手册使用。

D N A 大小标志

d N T P

准 备 1 0 mmol/LdN TP、无菌水溶解、 PCR级别去离子水6 分装保存一80°C 长 期（> 2 月）

—20°C ( < 2 月）

EB (1 0 m g /m l)

加 Ig EB 到 IOOml 去离子水中，搅拌数小时直到完全溶解。室温保存到不透光瓶子中。IO X 琼脂糖胶上样缓冲液（例如， 0 . 2 5 % 溴酚蓝、 0 . 2 5 % 二 甲苯 菁 F F 、 水溶解5 0 % 甘油）

H 2O P C R 级别

P C R 引物寡核苷酸

P C R 级别无菌水准备工作浓度 20u m o l/L ，分装保存-2 0 °C

模 板 D N A

酶 PCR 用 IOOng 质粒 DNA 或 cDNA。

50 X T A E (T r is/A c e ta te /E D T A )

溶解 242 g T r i s S 57. Iml 冰 乙 酸 ， IOOml 〇 . 5mol/L EDTA (186. Ig EDTA •2 H20 二 钠 ，加 水 到 1L ，调 p H 到 8 . 0 ) , 用去离子水稀释到 IX T A E 使用。

仪器

用于核酸分离的水平胶电泳仪，包括电源和适当的分离梳

用 3〜 5mm 的 梳 子 上 样 消 化 液 。大的上样量用于胶回收。所以推荐用 7〜 1 0mm宽 齿 梳子 。

P C R 纯化或胶回收试剂盒

P C R 仪

薄壁 P C R 管

紫外灯

方法

1.为产生初始 P C R 产物，准备如下反应：
模板 D N A (IOOng) I .Oul

聚合酶缓冲液 5. 0ul

和终止密码子序列而不是包括 2A 的 序 列（图 3)。

对于重组 PCR 改变复性温度不是必需的。延伸时间相应的延长引物产物的质量增大。重 组 PCR 可以使用超过两个 PCR 产 物 ，条件是片段之间的重叠序列不同，每个片段摩尔量相同。如果试验产生重组产物比较困难，分几个阶段重组PCR 反 应 ，每个阶段使 用 2〜3 个初始模板，直到产生全长的产物。要 知 道 ，增 加 P C R 循环数会提高出错概率。

7 . 如步骤 3 检测产物分子质量，如步骤 4 纯化产物。

8 . 限制酶酶切延伸引物中酶切位点，克隆终产物到表达载体中。

9.使用感兴趣的表达基因或载体特异性引物测序。重要的是要确保 2A 多肽序列正确，因为任何氨基酸组成改变会影响切割效率

检 测 2A 多肽切割

材料

试剂

抗蛋白质或 2A 抗体

D M E M 培养基

完全培养基和无血清培养基。完全培养基添加了 10% 胎牛血清、 2 mmol/L L-谷氨酸、1mmol/L丙 酮 酸 钠 、 100umol/L MEM非必需氨基酸、 5mmol/L HEPES、 5.5 x 10^-5 单 位的 β- 巯基乙醇 、 lOOU/ml 青霉素和 lOOug/ml 链霉素 。另外， 20ug/ml 环丙沙星
可以阻止支原体污染。所有试剂和培养基都有商业产品。

裂 解 液（如 诺 乃 洗 涤 剂 -P 4 0 或 R IP A 裂 解 缓 冲 液 ，参 见 H arlo w and L ane 1999)

磷 酸 盐 缓 冲 液（PB S)

质粒 D N A

转染试剂

许多转染试剂可用，但是我们发现转染 293T 细 胞 使 用 T m nsIT-LTl、 Tm nSIT-293T (M im s、 Madison、 Wisconsin) 或者 FuGENE 6 转染试剂（Roche)。 如果没有这些试剂 ，使用磷酸钙转染同样可以。

胰酶/乙二胺四乙酸

2 9 3 T 是贴壁细胞；使 用 胰 酶 ED TA 可以促使细胞脱离培养板减少细胞成团

指数生长 293T 细胞

仪器

S D S ^ P A G E Western 杂交仪

标准组织培养仪，包 括 I O O m m 板

这个方案设计针对 293T 细 胞 IOOmm 组 织 培养板培养。如果使用不同大小培养板培养细胞 ，适量调整细胞密度和试剂用量。

方法

1.转染前 24 h 胰酶消化收集细胞。

a. 去除贴壁细胞培养基（D M E M )， P B S 冲洗去除痕量培养基，加 3〜4m l 胰酶E D T A 。

b . 室温孵育 2〜3m i n ，直到细胞从培养板脱落。轻轻重悬细胞转移到圆锥管中，IOml 完全培养基洗板，转移冲洗培养基到管中，中和胰酶。

c. lOOOr/min 离 心 lOmin。 去除上清， 5m l 培养基重悬沉淀，细胞计数。接种细胞到 IOOmm 组织培养板浓度 2 X IO⁶ 个细胞/板 ，加 IOml 培养基。 37°C 过夜使细胞贴壁。

2.根据操作说明，选择试剂转染细胞。使用1 〇ug载体/板 ， 3 7 °C 孵育细胞 4 8 h 以上。

3 . 如步骤 1 一样，胰酶消化收集细胞。

4•检测切割，溶解细胞， S D S- P A G E 电泳分离蛋白质， W e s t e r n 杂交。封阻和探针选择适合靶蛋白质的标准程序。如果有研究蛋白质的抗体 W e s t e r n 杂交有效，可以用来检测切割的效率。 2A 多肽的抗体没有商品化产品，但是可以自己制备。根据蛋白质分子质量，它们可以鉴定感兴趣蛋白质从切割和非切割材料中区分开。

转染有多重顺反子载体细胞表达的蛋白质可以与编码单独蛋白质粒转染细胞对比。要知道，2A 标签会引起蛋白质分子质量的微小变化