基本方案2 DM 患者gDNA三核苷酸重复的杂交分析
最新修订时间：
原理
gDNA杂交分析对于确定DM>250bp 的扩增特别有效。此法可用于排除 E3 至 E4 类扩增（表 9.4.1)，后者通过 CTG-PCR 只有一条等位基因可见，并且 CTG-PCR 产物与（CTG)10 杂交不能检测到原突变或扩增（基本方案 1)。
材料与仪器
纯化的gDNA
EcoR I 限制性内切核酸酶 10 X 限制性内切核酸酶缓冲液 琼脂糖胶 1 X TBE 缓冲液 10 X 凝胶载样缓冲液 分子质量标记物 溴化乙锭 NaOH 中性化溶液 预杂交 杂交缓冲液 洗脱缓冲液
铸造托盘 厚梳齿 带正电尼龙膜 滤纸
EcoR I 限制性内切核酸酶 10 X 限制性内切核酸酶缓冲液 琼脂糖胶 1 X TBE 缓冲液 10 X 凝胶载样缓冲液 分子质量标记物 溴化乙锭 NaOH 中性化溶液 预杂交 杂交缓冲液 洗脱缓冲液
铸造托盘 厚梳齿 带正电尼龙膜 滤纸
步骤
![7. 在>500m l 0.4mol/L N a〇 H 溶液通过毛细管转移D N A 至带正电的尼龙膜。转移6h 至过夜。 8. 转移后，从凝胶上取下尼龙膜，置中性化溶液中轻柔振荡，孵育 15min。 9. 将膜轻放至滤纸上吸干。通过80°C 烘烤15min或交叉连接固定D N A 。 10. 在预杂交/杂交缓冲液中， 65°C 预杂交膜> lh。 11. 在预杂交/杂交缓冲液中， 65°C下，与 IO6C p m 柱纯化的 [«-32P] dCTP-pGB2.2杂 交过夜。 12. 杂交完成后，按照下述严格洗脱杂交膜： 洗 脱 缓 冲 液 洗 脱 两 次 ，每次l〇 min，室温； 洗脱缓冲液V —洗脱2 或 3 次，每次lOmin， 65〜70°C 。 13. 用滤纸将膜吸干，以塑料薄膜包裹。 14. 一80°C ，将杂交膜与带增光屏的X -A R 自显影胶片曝光过夜。](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/08/A14700335808048ebdwq32wkpng_small.jpg)
来源：丁香实验
