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    基本方案1 PCR 扩增的 DM 三核苷酸重复的杂交分析

    最新修订时间：

    材料与仪器

    DNA 样品
    dNTP 混合物 10 X PCR 扩增缓冲液 PCR 引物 Taq DNA 聚合酶 矿物油 琼脂糖凝胶 1 X TBE 缓冲液 溴化乙锭 10 X 凝胶载样缓冲液 预杂交 杂交缓冲液 寡核苷酸 洗脱缓冲液 Lumi-Phos 530 底物溶液
    PCR 管 铸造托盘 厚梳齿 尼龙膜 循环温度仪 喷涂器 放射自显影胶片

    步骤

    基本方案1 PCR 扩增的 DM 三核苷酸重复的杂交分析

    1. 标 记 〇.5ml P C R 管，包括每个D N A 样品及阳性对照（ 已知大片段D M 扩增的 D N A ) 和阴性对照（ 以水代替D N A )。 2. 按下述给每个样品准备P C R 反应混合物，或同时配制多个样品的总混合物，冰上保 存 （ 按 配 制 以 保 证 足 量 ） ： 华1 10mmol/L dNTP 混合物； 2. 5pd IOXPCR 扩增缓冲液含 15mmol/L MgCl2; lOng/jul P C R 引物1 (以引物Ib扩增产物比引物Ia大 64kb); 5 4 1 0 n g / y P C R 引 物 2; 7.25/J 高压灭菌水； 0. 25jul 5 U / M T 叫 D N A 聚合酶。 3.用单独的移液枪取<ljug D N A 人 P C R 反应管中。必要的话，反应物上覆盖 矿物油。 4•按照以下扩增循环进行P C R 反 应 （ 按照Perkin-Elmer 480型循环温度仪优化） 。 起始步骤： 96°C 3min 30 个循环： 96°C 3min
    60°C Imin 72°C I. 5min 最终步骤： 72°C IOmin 5. 在 I X T B E 缓冲液中准备73ml 1 . 8 %的琼脂糖凝胶（ 用于真空印迹者则< 1 % ; 支持 方案1)。 加 lOing/ml溴化乙锭至终浓度为0 •5pg/ml。 将胶倒入15cmX I Ocm带有 0. 8 m m 梳齿的托盘。 6. 每个P C R 产物取5 4 , 加 I O X 凝胶载样染料至终浓度为I X ，上 样 （ 包括一个泳道 的合适的分子质量标记物） 。 7•当溴酚蓝染料的前端离点样孔约3. 5c m 时，给凝胶照相。 & 当溴酚蓝染料的前端离点样孔约5. 5cm、二甲苯胺离点样孔约2c m 时，停止电泳。 9•通过毛细管转化C T O P C R 产物过夜（ 此法转化更彻底并优化大的D M 扩增的涂抹 带的分析）或真空印迹至带正电的尼龙膜几个小时（ 支持方案1)。按自选方法（ 即 采用烘焙或U V 交叉连接）将 D N A 固定到膜上。用钝头镊子处理膜边缘。不要留下 指 纹 （ 即使戴了手套） 。 10. 以预杂交/杂交缓冲液50°C 预杂交1.5h 至过夜。 11. 弃去预杂交/杂交缓冲液。加2〇4碱性磷酸酶处理的（ C T G )1 。寡核苷酸至20m l 新 鲜配制的预杂交/杂交缓冲液中（ 探针终浓度约为Inmol/L 左右） 。 50°C 杂交至膜 1.5〜2h。预热洗脱缓冲液I 、 n 至 50°C 。 12. 从预杂交/杂交缓冲液中取出膜，滤干多余液体，按以下步骤洗脱： 洗脱缓冲液I —洗脱两次，每次5min， 50°C ; 洗脱缓冲液II—- 洗脱两次，每次5min， 50°C ; 洗脱缓冲液ID—洗脱一次， 5min，室温。 13. 将膜置于干净平面，避免胶干透。在通风橱中，距离12〜18in向膜小心喷洒LumiPhos 530底物溶液，将膜完全并均匀覆盖。 U . 以塑料薄膜或保护性醋酸纤维薄膜将杂交膜包裹，边缘切实封严，防止多余的Lumi-Phos 530底物溶液泄露并造成人工产物。 15.将印迹暴露于Kodak X - A R 放射自显影胶片， 37°C 3 h 至过夜。

    支持方案 1 使用真空印迹设备进行 PCR 产物的快速转移

    1. 按照基本方案1 第 8 步操作，在 500m l 0.5mol/L N a O H /1.5mol/L N a C l 溶液中变性 含 P C R 产物的琼脂糖凝胶10〜15m m 。 2 . 以钝头镊子处理胶的边缘，修剪成15c m X 20c m 大小。将滤纸剪成25c m X 20c m 大 小，边角修圆。 3. 分离真空设备部件。将多孔渗水板粗面朝下放置，滤纸置于多孔渗水板上，用水湿 润滤纸并除去气泡。在滤纸上方放置干燥尼龙膜。 4. 将衬垫置于膜的顶端上，确保衬垫覆盖真空台面的“〇 ”形环。加少许水到过滤器以 检测压力并将压力表设置为40cm H 20 。 5. 将压力减至零并将凝胶置于衬垫的窗口。用遮蔽胶带覆盖有凝胶的孔。通过在凝胶 表面转动玻棒或IOml移液枪枪头除去凝胶与膜之间的气泡。 6. 以少量20X S S C 覆盖胶的表面，增加压力至40cm H 20 。 7. 以新鲜配制的20X S S C 注满槽孔，完全浸没凝胶，凝胶表面在液面以下0.5〜lcm。 保持压力40cm H 2O lh。 8. 转移近结束时，保持压力，同时倒出缓冲液。关闭压力，拿出凝胶。取出尼龙膜， 不要清洗。 9. 通过80°C烘 烤 15min或 U V 交叉连接固定D N A 。以 2X S S C 清洗固定后的尼龙膜 3〜5min。进行膜杂交（ 基本方案1，第 10〜15步）

    支持方案 2 DM 三核苷酸重复扩增的放射性检测

    1. 膜在预杂交/杂交缓冲液中以50°C预杂交I.5h。 2. 在预杂交/杂交缓冲液中，以 lOng/m 丨 柱 纯 化 的 [7-32P ] d A T P 末端标记的 (C T G )1 。寡核苷酸与膜50°C 杂交2h。 3. 按照下列步骤洗脱杂交膜（ 放射性标记比酶学分析更经得起严格标准的考验） ： 洗脱缓冲液I --- 洗脱两次，每次5min， 5S° C ; 洗脱缓冲液II--- 洗脱两次，每次5min， 55°C ; 洗脱缓冲液ID--- 洗脱一次， 3〜5. min， 55°C 。 4. 室温，将膜与X -A R 自显影胶片曝光〇.5〜3h。

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    来源：丁香实验

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