反转录病毒载体实验

瞬 时 转 染 产 生 载 体

材料

试 剂
CaCl2 (2. 0mol/L)

EKLO 培养基： DMEM 培养基加 1 0 % 胎 牛 血 清（DMEM-10)， 2 mmol/L L-谷氨酸盐 ， 100U/ml 青霉素， lOOjug/ml 链霉素

HEK 293T 细 胞（ATCC， CRL-11268)

HEPES 缓 冲 液（HBS): 混合 lOOpl 的 500 mmol/L HEPES-NaOH (pH 7.1)，125ul 的 2. Omol/L NaCl， 10ul 的 150 mmol/L Na2 HPO4-NaH2PO4 (pH 7. 0)，加 H 2O 到 lml。新鲜配置备用

磷酸缓冲液（PBS)

质粒

含 有 病 毒 >〇 /和 ewt; 基因的包装质粒

载体质粒

制备提取无内毒素质粒（如用 Q IA G EN 无内毒素纯化试剂盒）和决定质粒 D N A 的含量。

设备

生物安全柜

CO2 培养箱

无菌枪头

注 射 过 滤 器（0. 45um 孔径)

组织培养离心机

组 织 培 养 瓶（75 cm2)

方法

1.准 备 HEK 293T 单 细 胞 悬 液 以 5 X IO⁶密 度 接 种 在 75 cm2 的组织培养瓶，过夜培养。

2.取出培养瓶弃掉培养基，加 入 12 ml 新鲜的 D>10 培养基继续培养。

3.所有试剂使用前均需用 0.22um 孔径无菌滤膜过滤。用水稀释质粒到总体积 876ul，加 124ul 的 2. Omol/L CaCl2，轻轻混勻，再 将 这 D N A 悬 液（Iml) 滴 加 到 Im l 的H BS 中，云絮样溶液形成，室温放置 30 min，轻轻混勻，将 I.5m l 的 DNA/HBS 悬液加到培养瓶中，孵育过夜。

4.弃掉培养瓶中的培养基，力卩 5 ml PBS 冲洗后，加 12 ml 新鲜培养基到培养瓶中继续培养 20〜24 h。

5.从培养瓶中取出包含载体的培养基，用 0.45um过滤器过滤去除残留细胞，根据需要分装，储存在一 70°C 。

生成稳定的载体产生细胞

材料

试剂
CaCl2 (2. Omol/L)

D>10 培养基： DMEM 加 1 0 % 胎 牛 血 清（DMEM-10)

G418 根据包装细胞适合的标记来选择 histidinol 或 hygromycin B

PolybreneinPBS (4 mg/ml; 1000X )，过 滤 除 菌（SigmaAldrich)

沉淀缓冲液

混合 100/ul 的 500 mmol/L HEPE&NaOH (pH 7.1)、 125/xl 的 2. Omol/L NaCl, IOfil 的150 mmol/L N a2 HPO4-NaH2PO4 (p H 7.0), 加水至总体积 lm l，新 鲜 配 置 备 用 。

受 体 细 胞（如 NIH-3T3 或 HeLa)

Tris-Cl (10 mmol/L , pH 7.5)

Trypsin-EDTA

载 体 质 粒（必须带有选择标记）

包括一个仅携带选择性标记基因没有目的 cD N A 片段插人的载体作为阳性对照指示转染各步是否成功完成，再使用不携带反转录病毒载体的质粒作为阴性对照。准备去内毒素质粒母液（如用Q IA G EN无内毒素纯化试剂盒）和决定质粒 D N A 的含量。

设备

生物安全柜

CO2 培养箱

克隆环

felt-tip 笔

无 菌 滤 膜（〇.22um)

有盖玻璃培养皿（IOcm)

无菌枪头

硅 树 脂（或替代物）

组织培养皿（6 cm 和 10 cm)

离 心 管（12 cmX75 cm Falcon2054 或替代物）

镊子

方法

1.第一天：以 5X 10⁵ 细胞密度接种 PE501 包装细胞于 6 cm 培养皿中培养过夜。

2.第二天：用 4m l 新鲜培养基给 PE501 换液，用磷酸钙程序载体质粒DNA 转染细胞，方法如下。

所有试剂使用之前均用 0.2 2um 无菌滤膜过滤除菌。

a. 对于每一个质粒样品准备一个 DNA-CaCl2 溶液，按下面的方法混合。
25ul 2. 0mol/L CaCl2

10ug 载体 DNA (在 10 mmol/L Tris-Cl pH 7. 5 溶液中）

加水到 200ul

b. 准备新鲜沉淀缓冲液。用一个干净的12 mmX75 mm 多聚乙烯管，滴 加 200ul DNA-CaCl2 溶液到 200ul沉淀缓冲液中不断摇晃离心管。

混 合 溶 液 很 快 呈 淡 暗 色 ，如 果 溶 液 澄 清 或 者 有 大 块 沉 淀 都 是 错 误 的 。

c. 室温放置 3 〇 min，把混合好的缓冲液放人细胞培养皿中，摇晃培养皿使缓冲液分布均勻，孵育过夜。

3.第 3 天 ：将转染完的 PE501 细胞弃去培养基，加 4m l新鲜培养基。以 IO5 细胞密度接种 PT67 包装细胞于 6 cm 培养皿，为每一个将转染完的 PE501 细胞准备两个平皿。培养过夜。

4.用包含 4ug/ml Polybrene 的培养基给 PT67 换液，从每个转染完的 PE501 细胞的平皿内取出 3m l 包含病毒的培养基（留 Im l 培养基在用胰酶前不要让细胞干掉）， 将取出的培养基 3000 g•离心 5 min 以去除细胞和碎片。对每一个转染过的 PE501 细胞的平皿，取 Im l 包含病毒的培养基感染一盘 PT6 7 细胞，用 IOfjJ 感染另一盘 PT6 7 细胞 ，然后把 PT67 细胞放回培养箱。

5.胰蛋白酶作用后，以 1 : 2 0 稀 释 接 种 PE5 0 1 细 胞 于 6 cm 培养皿，培养基含有0.75 mg/ml G418 (激活浓度）、 4 mmol/L 组胺醇或者〇• 4 mg/m l 的均霉素 B，这依载体中选择性标记而定。把细胞重新放回培养箱。

6.第 5 天 ：胰蛋白酶作用感染 PT67 细胞，以 9 : 1 0 和 I : 1 〇稀释后接种细胞于 l 〇 cm培养皿。培养皿中有 IOml 培养基和选择的药物。

用 Im l 或 者 IOmI 病 毒 感 染 以 9 : 1 0 和 1 : 1 0 稀 释 的 P T 6 7 细 胞 导 致 一 个 4 对 数 排 列 的 稀 释液 ，这 为 分 离 克 隆 细 胞 株 产 生 合 适 的 克 隆 量 。

7.第 9 天 ：染 色 PE501 细胞，评 估 5d 后克隆的形成情况作为衡量 DNA 转染的效率。每毫克质粒； DNA 转染大约 1000 个克隆是非常有代表性的。

8.第 9〜14 天 ：传代转染 5〜IOd 的 PT6 7 细胞，直到耐药克隆形成并且能被看见为止。

9.从有少数量的克隆板中使用克隆环分离克隆。

a. 准备使用的克隆环：在 IOcm Petri 板的下部铺一层薄的硅树脂，在板中放入环以至树脂覆盖边缘末端，高压灭菌。

b. 分离克隆，放置克隆，用 felt-tip 笔在每个克隆板上画个圆圈。
举 板 子 在 灯 光 下 非 常 容 易 看 到 克 隆 ，但 要 小 心 不 要 洒 出 培 养 基 。我 们 发 现 在 空 气 层 流 装 置中 关 掉 气 流 对 于 避 免 放 置 的 克 隆 环 干 燥 非 常 有 用 。

c. 吸出培养基，放克隆环在克隆集落的上面，用镊子按下。

10.每个容器中加入一滴含 ED TA 的胰酶，观察胰酶的消化情况。

11.当细胞已经聚集，向每个环中加入培养基（―对一），把培养基用力吸人吸量管以移去细胞。
我 们 典 型 的 分 离 大 约 1 〇 个 克 隆 用 来 分 析 。

12.扩增后，用 Southeni 法分析一个完整载体结构的克隆带、高的载体滴度、存在辅助 病 毒（见下一页标志物分析）和插人基因的表达

病毒的收集和分析

1.准备病毒，更换培养基以产生载体细胞的汇合培养物代替。 12〜24 h 后收集培养基于 3OOOg 离 心 5 min 培养液以移除细胞和残余碎片。用同一板细胞可以每隔 12 h 重 复 3〜4 次 。包含培养基的病毒能立即用来感染受体细胞。冻存在一 70℃以备将来使用。

2.测定载体滴度

a. 以 5X 10⁵个/6 cm 板的细胞密度接种受体细胞（如 NIH-3T3 或者 HeLa) 过夜生长。

b. 用包含 4/xg/m l 的 1， 5-二甲基-1， 5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物的培养基换液。加各种比例稀释的实验病毒。过夜培养。

c. 胰酶消化细胞，并用含〇 .75 mg/m lG418 (激活浓度）培养基 1 : 2 0 的比例稀释以便于载体运送基因，用 4 mmd/L 的 组 胺 醇 以 运 送 基 因 ，用 0.4 mg/ml的潮霉素 B 以运送 Z 1 灿 基 因 。根据细胞株调节浓度，继续培养。

d. 5〜7d 后 ，染色、计数克隆。计算病毒滴度。

辅助病毒的标志物分析

此分析检测了那些来自于包含一个载体但不是产生一个载体的细胞中的病毒样本反转录载体的能力。检测一个给定的辅助病毒的能力分析依赖于辅助病毒是否能感染细胞 。例如， ecotropic 辅助病毒不能通过人的细胞来检测。因此我们必须选择和辅助病毒相匹配的细胞来用（参考文献 22)。该分析稍微有点慢而且有点繁琐。但是，它非常的敏感，而且是本文反转录病毒设计和诱导载体能力中最重要的特征性检测方法。在这里步骤 8 以下是可供选择的。

1.为了使细胞包含一个载体而不是释放载体，用传送选择性的标记物（我们使用运送基因的 L N 载体）的无辅助性的载体来感染 NIH-3T3 或 者 HeLa 细胞，为存在的 基 因（对于 w o 的 G418) 选择细胞。

该 病 毒 能 从 产 生 高 滴 度 载 体 的 细 胞 株 中 获 得 。

2.两周内，传代细胞以使潜在的辅助病毒（不应该是现有的）扩散。分别使用 NIH-3T3 细胞分析细胞载体的产生，用 HeLa 细胞分析病毒的产生。

3.保存不能产生载体的细胞用来标记补救分析（步骤 4 叙述的方法)。

4.接种在步骤 3 中鉴定过的包含 M0 载体的非生产细胞（NIH-3T3 或 者 HeLa 细胞）于 5X 10⁵ 个/6 cm 的培养板中，生长过夜。

5.加 Im l 的 实 验 病 毒（3 〇〇〇 g•离心 5m in 除去细胞和碎片）， 3m l 规 律 的 培 养 基 ，知 g/ml 的 1， 5-二甲基-1， 5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物感染非产生细胞。有少量的双向辅助病毒质粒 [如用 pAM-MLV (Miller and Buttimore 1986) 转染的 NIH-3T3
细胞产生 1^1 或更少的病毒。两周内传代，使细胞完全被感染] 作为感染阳性对照。其他的辅助病毒在非生产细胞中能复制。

6.两周内传代细胞使辅助病毒扩散（为了取得临床材料的资格时间可调为 3 周 ，见Wilsonetal.1997)。小心操作不要交叉污染培养物，其中的一些开始时以非常高的滴度感染复制病毒，一周内胰酶消化细胞 2〜3 次。用 I : 10〜1 : 4 0 的比例稀释液重新接种细胞，使细胞有相对高的密度以使病毒容易扩散。

7.传代非生产细胞 13d 或 者 20d 后（见步骤 20)，以 IO⁵ 个/6 cm 板的密度接种首次用于实验的 NIH-3T 3 或 者 HeLa 细 胞（和使用的非生产细胞—样的细胞类型）于培兼板中。生长过夜。

8.从非生产细胞中收回培养基，在 4ug/ml 的 Polybrene 存在下用 lml 的样本感染用于初次试验的 NIH-3T 3 或 者 HeLa 细胞。 300 吆 离 心 5 min 培养基以除去细胞 U 和碎片一些耐药的活细胞能随着培养基转运以致显示一个假阳性的结果。放新的碌 朐回培养箱。生长过夜。

9.用含有 G418 (对于 NIH-3T3 细胞 0 •75 mg/ml 的激活浓度，对 于 HeLa 细胞 L 〇的激活浓度）的培养基给新感染的细胞换液。

10.5d 后 ，染色，计数克隆数。克隆集落的存在说明了在实验样本中，辅助病毒补救了卿载体。通 常 ，这 是 非常明显阳性板上面覆盖了 一 层耐药克隆集落。

细胞株的转导

材料

试剂

细胞培养基（能使细胞转导的正常生长培养基)

鱼精蛋白硫酸盐或者 Polybrene

反转录病毒载体材料

实验用细胞

设备

生物安全柜

CO2 培养箱

无菌枪头

水浴，预先设定在 37°C

组织培养离心机

组织培养瓶

方法

1•准备实验细胞单细胞悬液并计数每毫升细胞数。为转导组和模拟转导对照组准备培养物。假如转导总体选择的药物参与其中，准备一个次级的模拟转导对照组以作为评价药物潜力的选择对照。对于贴壁细胞，在每个 75 cundefined组织培养容器中， 2 12m l 适当的培养基中含 5X 102 个细胞，在 37°C ， 5 % CO2 培养箱中培养过夜。

2.在 37°C 水浴中迅速解冻载体并准备稀释液。从细胞暴露到解冻的时间应尽可能的短。

3.吸出并弃去细胞中的培养基。

4.按下面的方法转导。

a. 载体转导：在每个 75 cm2 5 6 容器中加入 4 ml 含有培养基的载体，培养基含： 10ug/ml

鱼精蛋白硫酸盐或者 8ug/m l 的 Polybrene。

b. 模拟转导：向适当的对照培养物中加入 im l 含 lOug/m l 鱼精蛋白硫酸盐或者4ug/m l 的 Polybrene 的新鲜培养基。

加 人 多 聚 阳 离 子 如 精 蛋 白 硫 酸 盐 或 者 Polybrene 是 为 了 增 强 带 阴 离 子 电 荷 的 细 胞 和 载 体 粒子 之 间 的 相 互 作 用 ，结 果 能 使 转 导 效 率 增 加 1 0 倍 以 上 。 IOOOX 的多聚阳离子溶液配置是非常 方 便 的 。多 聚 阳 离 子 对 于 原 代 细 胞 和 某 些 细 胞 株 ，假 如 这 样 ，可 以 测 试 一 个 有 最 小 毒 性但 最 佳 基 因 转 染 的 合 适 使 用 剂 量 。

C.把细胞放回 37°C ， 5 % ( ：〇 2 培养箱中。向载体暴露细胞 4 h。对 于 细 胞 株 ，一 般 来 说 ，多 于 4 h 并 不 能 明 显 增 强 细 胞 的 转 染 效 率 。为 了 增 强 基 因 的 转 染 ，优 先 选 择 在 连 续 数 天 内 重 复 转 染 的 方 法 ，前 提 是 细 胞 已 经 进 人 转 染 周 期 。

d.培养后，吸去容器中的培养基，加入新鲜的培养基然后放到培养箱中继续培养。

5.最佳的细胞选择或者细胞分类：经常产生的载体伴随着转导总体增强的标记基因表现出特殊的转基因力。如果进行了选择，转导后加人选择的标记药物 24〜48 h。对照组包括含有药物或者没有药物的模拟转导培养物。假如分子表达在表面或者荧光蛋白被表达，载体表达细胞就很容易被分类，大多数的转导细胞载体的表达需要等 72 h以保证有充足的时间。

6.大多数细胞株大约转导 72 h 后能看到整合的转基因的稳定表达。在接下来的使用中，细胞能用来分析或者扩增。

原始造血细胞的转导

材料

试剂

细胞生长培养基（完全的和无血清的）

Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) 含 1 0 % 的 胎 牛 血 清（FBS)、谷氨酰胺、 20^g/ml 的庆大霉素或者含 1 % 人血清白蛋白和 20/xg/ml 的庆大霉素 X-Vivo 培 养 基（Cambrex)

细胞分离缓冲液（Invitrogen)

细胞

对于小鼠祖干细胞， 5-氟尿嘧啶处理的小鼠收集骨髓细胞或者使用 VarioMACS (MiltenyiBiotec) 浓集阴性细胞。对于人祖干细胞，用 VarioMACS (Miltenyi Biotec) 的方法从骨髓、外周血中分离。用荧光激活细胞分类术浓集多数原代造血细胞

细胞因子鸡尾酒（通常用来刺激细胞）

Flt3-配基-血小板生成素（TPO) + 干细胞因子（SCF) (每份 lOOng/ml)粒细胞克隆刺激因子（OCSF) + Flt3 配基+ TPO+SCF (每份 50〜100ng/ml)

OCSF+ TPO+SCF (每份 100ng/ml)

白细胞介素-6 (IL-6) (lOOU/ml) +SCF (每份 lOOng/ml)

磷酸盐缓冲液（PBS)

Retronectin

Retronectin 可 以 作 为 低 压 冻 干 粉 使 用 或 者 在 预 涂 布 的 35m m 板（Takara， www. takaramirusbio.com 或 者 Cambrex， www. cambrejc com) 上 使 用 。用 无 内 毒 素 的 蒸 懷 无 菌 水 准 备Retronectin 材 料（Img/ml) 。

反转录病毒载体材料

设备

离心机

荧光激活细胞分类仪器（FACS)

显微镜

Petri 皿或者多孔板

一次性的塑料制品（处理非组织培养： BDBiosciences)

聚丙烯管

VarioMACS (Miltenyi Biotec) 用来强化大多数的原代造血细胞

方逢

1.在转导前 12〜48 h，接种每毫升 2X 10⁵〜4X 10⁵ 个的细胞用来转导（培养基含有细胞因子)。用一个实验性的方法测定预刺激期的长度和转导细胞周期的数量

2.在转导的当天，按照下面的方法用 Retronectin 涂布平板。

a. 在聚丙燦管中用 PBS 稀 释 Retronectin，然后，以 2〜5ug/cm2 涂布无组织培养的 平 板（见下表涂布 2jutg/cm2)。例如，涂 布 24 孔板，加 4/^1 的 Retronectin 到0.5m l 的 PBS 使每个孔都被覆盖。吸吹混匀后加人孔中。

使用无组织培养的培养板是因为它的表面的疏水性能促使 Retronectin 键合得最佳。板 的 大 小 和 Retronectin 的 覆 盖 浓 度 ：

b. 在室温下培养 2 h 或者包在塑料包裹中 4°C 培养过夜。

C . 使用前，吸出 Retronectin/PBS 溶液。

3.测定细胞转导的大概数量。用 Retronectin 在 I.OXlO⁵〜2. OXlO⁵ 个/dn2的密度转导

4.接下来预刺激，收集、计数细胞。培养基和反转录病毒载体上清的比例是 1 : 1，并用细胞因子鸡尾酒补充。

5.4 h 后 ，收集没有贴壁的细胞，离心。加含细胞因子的新鲜培养基，再离心，放回没有贴壁的细胞后培养箱中培养过夜。每个转导循环都需要这样做。

在 连 续 数 天 内 ，细 胞 转 导 2〜3 个 循 环 ，只 要 细 胞 不 是 太 密 集 保 持 细 胞 在 同 一 块 Retronectin板 上 。如 果 细 胞 变 得 密 集 ，收 集 后 换 一 块 新 的 Retronectin 板 。

6.最后的转导循环完成后，培养过夜。

7 重悬细胞后放入管中，把 PBS (每 IOcm 板 用 5 ml; 6 孔板中的每孔用 3 ml) 洗每个板的洗液倒进管中。加分离缓冲液（ 和 PBS—样的体积）后放在通风橱中 2〜3 min。
轻拍板的边缘，收集残余的细胞直至显微镜下观察没有细胞残余。