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    从石蜡包埋组织制备细胞核悬液用于荧光原位杂交 (FISH) 分析实验

    相关实验：利用石蜡包埋组织鉴定染色体非整倍体

    最新修订时间：

    材料与仪器

    待检石蜡包埋组织
    二甲苯 乙醇 胃蛋白酶溶液 PBS 2 X SSC 丙酮 生物素 杂交液 洗脱液 0.1 XSSC 溶于磷酸缓冲液中的去垢剂
    带刀片切片机 锥底玻璃离心管 转筒形转头 水浴箱 注射器 单纤丝尼龙过滤网 染缸 玻璃盖玻片 乳胶黏合剂 恒温箱 孵育玻片的湿盒

    步骤

    1. 用切片机从待检石蜡包埋组织中切下1〜3 片厚50^111的 切 片 （ 对于绝大部分类型的 组织，两块IcmX Ic m 大的切片已含有足够数量的细胞核可用于最少I0 个探针的杂 交了） ，置于15m l 锥底玻璃离心管中。 2. 加人5m l 二甲苯，放置5min，并不时用手晃动离心管。室温下200g 离心5min。吸 去上清。 3. 用以下溶液重复第二步操作： 二甲苯； 1 0 0 % 乙 醇 ； 9 5 % 乙醇； 8 0 % 乙醇； 7 0 % 乙醇； 5 0 % 乙醇； 去离子水（ 两遍） 。 该 步 骤 操 作 成 功 的 话 ，将 不 会 再 有 质 硬 的 白 色 斑 点 蜡 状 的 石 蜡 残 留 于 组 织 内 。 如 果 仅 有 极 少 量 石 蜡 碎 片 残 留 ， 用 适 当 工 具 将 其 剔 出 。如 果 难 以 剔 出 石 蜡 碎 片 ，则 标 本 需 按 照 与 以 上 洗 涤 顺 序 相 反 的 顺 序 再 次 脱 水 （ 开 始 用 水 洗 最 后 用 二 甲 苯 洗 ） ， 然 后 重 复 去 石 蜡 化 及 再 水 化 。 4. 加入Iml胃蛋白酶溶液消化， 37〇 C 摇晃式水浴箱中水浴3〇min。 5. 用连接18G 针头的5m l 注射器将标本剧烈地上下抽吸吹打数次以打散细胞团块（ 一 些细胞团块将始终存在） 。 6. 用单纤丝尼龙过滤网过滤标本，将标本过滤至15111丨离心管中。 7. 于消化管中再加人4ml P B S 洗涤并过滤。将管中P B S 溶液倾倒于过滤网上过滤至第 6 步的离心管中，然后再往过滤网上倾倒4 m i ?6 3 洗涤滤网，仍将滤液置于同一个 离心管内。弃去滤网。 8. 室温下200g•离心I0min。吸去上清。用 2ml p B s 重悬细胞沉淀。用连接21G针头的 5m l 注射器将标本剧烈地上下抽吸吹打数次。 9. 室温下200g 离心I0min。吸去上清。用巴氏吸管吸取p B S 重悬含独立分散细胞核的 沉淀并滴片。 两 种 不 同 探 针 可 同 时 在 一 张 玻 片 上 进 行 杂 交 。 如 果 需 进 行 该 操 作 ， 滴 片 时 玻 片 两 端 都 应 滴 上 细 胞 核 悬 液 （ 图 8.5.1) 。 10. 将玻片置于空气中干燥至少^ h。室温下敞开于空气中存放不能超过1 个月。若需 长时间存放，则应于4°C 干燥箱中保存。
    11.将玻片依次浸入含有下列溶液的50ml染缸中脱水，每个染缸内浸泡玻片2min，溶 液均为室温： 2XSSC; 7 0 % 乙醇； 8 0 % 乙醇； 9 5 % 乙醇； 1 0 0 % 乙醇； 丙酮。 空气中干燥玻片。如需要可于室温下存放数夫。 12•在15^1杂交液中加人1〜1.25^1 (终浓度为lOng/^l) 生物素或地高辛标记的待检 染色体的着丝粒探针（ 单 元 4 . 4 ) ( 针 对 2 2 m m X 2 2 m m 盖玻片）。 I 3•将探针混合液滴于玻片上，盖玻片覆盖于玻片上，排出气泡。在盖玻片边缘用乳胶 黏合剂封片。 如 果 在 一 张 玻 片 上 同 时 用 两 种 探 针 杂 交 ， 则 先 加 一 种 探 针 ， 封 片 （ 通 常 为 2 2 m m X 2 2 m m 盖 玻 片 ） 后 再 加 另 一 种 探 针 以 免 两 种 探 针 混 淆 （ 图 8.5.u 。 14. 90°C恒温箱中孵育玻片5〜IOmin, 使探针和靶DNA变性。 如 果 细 胞 核 由 于 组 织 固 定 或 保 存 中 的 某 些 未 知 原 因 而 变 得 比 较 脆 弱 的 话 则 应 减 V 变 性 时 间 至 5min以 内 或 降 低 变 性 温 度 至 75°C， 以 最 低 限 度 减 少 杂 交 信 号 的 丢 失 或 减 弱 。 15. 将杂交玻片置于湿盒中，于 37° C恒 温 箱 中 杂 交 过 夜 （12〜i 8h) ，使探针与靶DNA 充分杂交。 16. 在 含 有 39°C洗 脱 液 的 50ml染缸中洗涤玻片两次，每 次 15min (单 元 “ )。洗涤玻 片过程中需不断搅动玻片以充分洗涤干净。 17•将玻片置于含有39°C 的 0.1X SSC 的染缸中，于 39°C摇晃式水浴箱中水浴30min。 18. 将玻片转至含有室温PBD的染缸中，室 温 下 放 置 2min，并轻轻搅动玻片。玻片在 4°C下 于 PBD中保存不得超过2 周 ，但该步骤中不可将玻片髯于空气中干燥。 19. 按照单元4. 4 的操作对染色体进行复染并检测探针信号。 20. 荧光显微镜下观察杂交玻片，记录每个细胞核中原始杂交信号的数量(荧光强度最
    强的） ，忽略那些荧光信号强度较低的非特异性信号。 备选方案从石蜡切片中制备细胞核悬液用于荧光原位 杂 交 （ F IS H ) 分析 附加材料（ 标V 的条目参见附录1) 1 0 % 、 2 0 % 或 30% W V ) 亚硫酸氢钠（ Sigma) 25mg/ml 蛋白酶 K (Sigma; —20°C 保存） V 硅烷化玻璃显微镜玻片 65°C 恒温箱 1. 用切片机从石蜡包埋组织中切下2〜IO^m 厚的切片，将切片置于硅烷化玻璃显微 ^ 玻片上，使切片漂浮于水中。 & 最 佳 的 切 片 厚 度 取 决 于 组 织 的 全 部 细 胞 构 成 及 胞 间 基 质 （ 如 结 缔 组 织 ） ， 通 常 针 对 不 同 的 组 织 类 型 应 采 取 不 同 的 切 片 厚 度 （ 某 些 情 况 下 不 同 病 例 的 样 本 亦 应 有不同 处 理 ） 。理 想 情 况 下 切 片 的 厚 度 应 尽 量 使 细 胞 核 的 重 叠 程 度 最 低 以 使 每 个 细 胞 核 都 可 以 被 检 测 到 （ 细 胞 核 平 均 直 径 为 5〜 15Mm ) 。 除 此 之 外 ，在 较 厚 的 切 片 中 大 量 的 细 胞 间 基 质 将 更 加 突 出 ，这 将 在 一 定 程 度 上 使 杂 交 信 号 变 得 模 糊 不 清 。 2. 空气中干燥玻片， 65°C 恒温烤箱烤片过夜使组织黏附于玻片上。 3. 组织切片的脱蜡处理. ：将玻片放入含有二甲苯的50m l 染缸中lOmin，然后放人含有 100%乙醇的染缸中洗涤两遍，每次5min。不时晃动玻片。空气中干燥玻片。若需 亚硫酸氢钠处理，则按照第4 步操作，如果不需亚硫酸氢钠处理则直接按照第5 步 进行蛋白酶K 处理。 4. 亚硫酸氢钠处理：将玻片放人含有10% 、 2 0 % 或 30% (m /V ) 亚硫酸氢钠溶液的染 缸中， 43° C 水浴箱中水浴1〇〜30min。将玻片置于室温下含有下列溶液的染缸 中 ， 按照以下操作进行洗涤和脱水处理： 2 X S S C 两遍，每次Imin; 7 0 % 乙醇 2min; 8 0 % 乙醇 2min; 90%乙醇2111丨11; 100%乙醇 2min。 空气中干燥玻片。 亚 硫 酸 氢 納 理 论 上 可 以 通 过 增 加 酶 与 组 织 的 接 触 而 提 高 蛋 白 酶 K 的 活 性 。 那 些 . 耐 消 化 的 组 织 需 要 更 长 的 消 化 时 间 和 高 浓 度 的 预 处 理 液 进 行 预 处 理 。 该 处 理 的 必 要 性 还 存 在 很 大 争 议 --- 但 如 果 杂 交 信 号 非 常 微 弱 则 需 进 行 该 步 处 理 。 一 S•在4〇 m l 2 X S S C 中加入40〇 m 1的 25jug/m l 的蛋白酶K ，倒入染缸中，水浴中预热 至 37。。。 6. 将玻片置入蛋白酶K /S S C 溶液中， 37。 〇水浴箱中水浴1〇〜40min。 7. 室温下2X S S C 洗漆玻片3 遍，每次im i n。 8. 将玻片依次浸入下列室温下的溶液中进行脱水处理，每次2min:
    70%乙醇； 8 0 % 乙醇； 9 5 % 乙醇； 1 0 0 % 乙醇； 丙酮。 9.空气中干燥玻片，按照基本方案第12〜20 步操作进行杂交处理。

    来源：丁香实验

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