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    使用双功能团试剂将合成肽偶联至载体蛋白

    相关实验：抗肽的抗血清制备以及从多肽库中筛选 B、T细胞抗原表位

    最新修订时间：

    原理


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    材料与仪器

    步骤

    基 本 方 案 使用双功能团试剂将合成肽偶联至载体蛋白

    材 料

    家兔

    肽-载体的连接体（单 元 13. 1)

    P B S , p H 7. 5

    弗 氏 完 全 佐 剂（F C A ; Pierce Biotechnology)

    弗氏不完全佐剂

    1 . 收 集 血 样（如从耳动脉或耳静脉），每只家兔准备 2〜5m l 免 疫 前 的 血 清（单 元 1.2)。至少准备 2 只家兔，以防一只家兔死亡或者免疫接种失败。

    2 . 将 0.7〜L O m g 的肽-载体的连接体溶于 I m l 的 P B S ， 并 加 入 Iml F C A 彻底混溶。每只 家 兔 免 疫 接 种 I m l 这 种 稳 定 的 乳 浊 液 ，在 皮 下 多 个 位 点 接 种 ，每 个 位 点 0.1〜
    0•2 ml (单元 1. 2 ) 。

    3.2〜6 周 后（或检测到免疫反应减弱时较理想；见基本方案 2)，准备一份新的乳浊制剂追加剂量，使用相同的连接体但添加的是弗氏不完全佐剂。如上所述在皮下多个位点接种。若免疫原的量有限，则使用初次免疫接种量的 1/4。

    4 . 在加强免疫后 3 周取家兔血样，在 4 周后再次取血获取抗肽的血清。检测免疫反应(见基本方案 2)。

    5 . 可选 ：若 5〜6 周后免疫反应依然较低，在 10〜1 2 周再次加强免疫一次。并在最后一次接种后 3〜4 周后再次取血。不要第三次加强免疫。

    6 . 在免疫反应最强的时候在动物身体许可的范围内取尽可能多的血样。对有免疫反应的兔子在合适的时间取血，这取决于对抗血清质量的要求或已获得了足够多的抗血清 。将血清储存在一 70°C 。

    7 . 可 选 ：通过免疫亲和层析法，将 抗 血 清 中 不 需 要 的 成 分（如抗载体的抗体）去掉以纯化抗肽的抗体。

    基 本 方 案 2 用 间 接 ELISA 法检测抗多肽抗体滴度

    这种检测方法能从长度大于 1 5 个氨基酸的肽中筛选出抗血清。对于较短的肽链，可用生物素标记肽链（单 元 9. 3 ) 或者用不同于获得抗血清时使用的肽-载体偶联体包 被 反 应 板 （单 元 13. 1)。 材 料 （带V 项 目 见 附 录 1) 0.2〜2. 5M m 〇l/L 合 成 肽 （长度> 1 5 ) 溶 于 O.lmol/L 的 碳 酸 钠 盐 溶 液 （附 录 1 ) 使 得肽-载体连接体中肽的浓度为约lpmol/L 。 V 封闭液 V P B S T 抗 多 肽 血 清 （见基本方案1) 阳 性 对 照 （如血清或已知抗体） 偶联体探针：羊抗兔的免疫球蛋白偶联到碱性磷酸酶（Kirkegaard Perry Laboratories) V 碱性磷酸酶底物溶液 9 6 孔培养板，干净的聚苯乙烯的微量滴定培养板较优 滤光片/单色光镜吸收值为405〜415n m 的酶联仪 1 . 用 I O O fX l溶 解 在 0. Imol/L 的碳酸钠盐溶液的0.2〜0.5M mol/L 合成肽混合液，包被 % 孔培养板，并确保每个孔的底部覆盖均衡。在 4°C 下孵育过夜或在室温条件下放 置 2 〜6h 。如果肽抗原不能吸附上去，将它们溶于其他的pH4 〜8 的缓冲液，或使用 经处理的能特异结合蛋白质的微孔培养板。 2 . 吸弃孔内的肽溶液，将培养板在水槽上轻拍。 3 . 每 孔 加 入 200/xl封闭液，封闭培养板小孔中依然有活性的位点，并在室温条件下孵 育> 3 0 m i n 。每 孔 加 入 约 300M 1 的 P B S T 洗 涤 3 次 ，并将培养板放在水槽上方轻轻 拍击。 4•准备至少8 份 以 上 300； xl封 闭 液 连 续 稀 释 抗 肽 的 抗 血 清 溶 液 ，范 围 从 1 : 100〜 1:12 000或更高。同样将阳性对照（血清或已知抗体）和 阴 性 对 照 （无血清）连续 稀释在封闭液中。添 加 100/xl样品或者对照到培养板各孔内并孵育> l h 。再 用 P B S T 洗涤各孔3 次 。为了防止交叉污染，不可将孔中添加过满。 5 . 按生产商的推荐浓度将偶联体探针溶于封闭液（1 : 1000到 1 : 5000)。每孔内加入 100M 1偶联体，室温条件下放置l h 。用 P B S T 将培养板洗3 或 4 遍 。 6 . 加 入 100/xl碱性磷酸酶底物溶液，室温条件下孵育> 2 0 m i n ，直到可以观察到溶液有 黄色出现。 7 . 用酶联仪在405n m 波长下检测其光吸收值，并找出光吸收值显著增强的抗肽的抗 体 。注意：用 E L I S A 检测，样品中抗体的结合数量和平均亲和性要更优。 基 本 方 案 3 使用酸性、碱性或离液洗脱液的亲和层析柱 除掉血清中产生的抗载体蛋白的抗体以达到纯化产物的目的。采用肽链亲和层析纯 化出的抗体或许能够与肽抗原结合。然而 ，为了确保抗体可以结合完整的蛋白质抗原， 亲和层析纯化时要使用完整的蛋白质序列。使用酸性洗脱液是常用的洗脱抗体的方法， 若不能成功洗脱，则尝试碱洗脱液或离液洗脱液。也有研究者将三种方法混合使用以增
    强被遮盖抗体的特异性。 材 料 （带V 项 目 见 附 录 1) V 磷酸钾盐/N a C l 溶 液 （添加叠氮钠保存柱子） 含有抗肽抗体的已知抗血清 平衡缓冲液： lmol/L T r i s . Cl， p H 7.5 (附录 1) n/ 洗脱液 V P B S T 亲 和 柱 （见辅助方案1 和 2) 0. 45y m 的针孔式滤器和3m l或 5m l的注射器，并结合牢固 13m m X 100m m 的检测杯 1 . 检查亲和层析柱，若有明显的细菌生长，则丢弃不用；若里面有少量的气泡未被填 充 ，则重新填充。 2 . 预先平衡层析柱，用磷酸钾盐/N a C l 溶 液 洗 涤 直 到 检 测 设 备 （如 分 幵 或 联 机 的 M V 检测仪）显示光吸收值在254〜280n m 基 线 范 围 内 （<0. 1A U )。依靠自身的重力或 泵的压力运行。对于直径 I c m 的柱子，最好使整个过程的流速< lml/m i n 。 3 . 准 备 1〜2m l抗血清样品，加入到已经过磷酸钾盐/N a C l溶液平衡的柱子内。 4 . 使用结合牢固的〇.45^011的针孔式滤器和3m l 或 5m l 的注射器过滤稀释过的血清， 或室温， I O O O g 离 心 l O min。 5 . 将样品加入亲和层析柱中，收集流出的未结合的抗血清。如果需要，再次色谱分析 流出的血清，其中也许含有重要的抗体。 6 . 用> 2 0 m l 的磷酸钾盐/N a C l 溶液清洗柱子，检测洗脱液直到 U V 光吸收值回到基线 附近。 7 . 准 备 1 0 个 13mmX IOOmm的检测杯，如果使用的是酸性或碱性洗脱液，在杯中加入 0.2m l的平衡缓冲液；如果用的是离液洗脱液，加水即可。 8 . 用 5m l 合适的洗脱液洗脱柱子，收 集 I m l 放入已加平衡缓冲液的检测杯中（酸性或 碱性洗脱液）或 加 水 的 杯 中 （离液洗脱液）。若是酸性洗脱液，还应振荡检测杯混合 溶液并防止抗体较长时间暴露在低p H 下 。 9 . 在 背 景 水 平 上 （如包含抗体），检测已中和部分的洗脱液的U V 光吸收值。典型抗体 在 l m g /m l 溶液中 A 28 q 的吸收值为1. 4。 10. 收集几份包含抗体的缓冲液（通 常 为 3〜5 份），在 4°C 下至少更换两次100倍体积 的 P B S T 进行透析。产物储存在一70°C ，根据需要也可分为几部分储存。 11. 洗脱抗体后，尽 快 用 20m l 磷酸钾盐/N a C l溶液清洗柱子。若要储存柱子至下次使 用前，则加入叠氮钠并保存在4°C 。 辅 助 方 案 1 预 先 溶 胀 的NHS或 CNBr活化树脂的肽免疫亲和层析柱的制备 C N B r 活化的树脂，与 iV-羟 基 琥 珀 酰 亚 胺 酯 （N H S ) 活化的树脂不同，在树脂基 质与结合位点之间没有间隔段。这就增加了空间的改变，影响了与抗体的结合。但 是 ， 这种树脂能有效地用于长的肽链和蛋白质抗原。
    色谱仪的生产商已提供了详细的使用说明。本方案只简单介绍这些方法，具体方法 详见生产商的说明书。 材 料 （带V 项 目 见 附 录 1) 带有一个游离氨基团的肽（最好不含Lys) JV， JV-二 甲 基 酰 胺 （D M F ) 活 化 的 树 脂 （选一个）： 溴 化 氰 （C N B r ) 活化的 Sepharose 4 F F ( A m e r s h a m Biosciences) N -羟基琥珀酰亚胺酯（N H S ) 活化的树脂： Affi-GellO (Bio-R a d ; 适用中性 的和碱性肽）， Affi-Gel 15 (Bio-R a d ; 适 合 酸 性 肽 ），或 N H S 活化的 Sepharose 4 F F ( A m e r s h a m Biosciences; 适合酸性肤） lmol/L 的乙醇胺 . H C U pH8 或 lmol/L T r i s . C l， pH7.5 (各自配方见附录1) V 磷酸钾盐/N a C l 溶 液 （添加叠氮钠保存柱子） VPBS9 pH7. 5 15m l 带盖的非聚苯乙烯离心管 30m l 玻璃陶瓷漏斗或30m l 的布氏漏斗 I c m X I O c m 的玻璃或塑料层析柱 1 . 将 I O m g 带一个游离氨基团的肽溶于4m l D M F 。如果有必要，过滤或短时离心使之 澄 清 （如室温， I O O O g 离 心 IOmin)。 若肽不溶于D M F ，可 以 尝 试 D M S O 、 甲 醇 、 乙 腈 、二嚙烷 、丙酮、 50m m o l / L 磷 酸 钠 盐 （p H 7,5) /0.4mol/L N a C l 或者这些溶剂的混合液。若使用的是水溶液， 保 持 p H 接近中性。在偶联过程中避免使用含有自由氨基的溶剂或缓冲液，比如 Tris或铵盐。 2a. 若 是 C N B r 活化的树脂：称 取 I g 干燥的 C N B r 活 化 的 Sepharose 4F F 树脂，并放人 15m l 非聚苯乙烯离心管中，加 入 10 m l 去离子水并在室温条件下温和混匀I h 或在 4°C 下过夜。一旦再水合，则不要让树脂脱水。 2b. 若 是 N H S 活化的树脂：在打开瓶子前摇晃，使树脂能均衡地悬浮。 3 . 将 6〜8m l 的黏结剂转移到30m l 的玻璃漏斗或布氏漏斗。真空泵温和地抽提溶剂， 但要防止树脂干燥过度。 4 . 尽 快 用 10〜20m l 去离子水清洗树脂三次，每次都充分搅拌以分解团块并促进再次水 合 。避免树脂完全干燥。 5 . 用一个刮勺将树脂形成的团块转移到15m l 的非聚苯乙烯的离心管中。加入肽溶液 (步骤1 ) 并盖上盖子。使用搅拌器在室温条件下温和的搅拌I h 或 在 4°C 下 搅 拌 4h 。 添加 0 •5ml 的 lmol/L 乙 醇 胺 •H C 1， p H 8 (或 lmol/L Tris • Cl, P H 7. 5 ) 并温和 搅 拌 l h 。 6 . 将黏结剂倒入一个干净的玻璃漏斗，抽提反应混合液并用1〇 〜20m l 的去离子水洗三 遍 。用等量的磷酸钾盐/N a C l 溶液再悬浮树脂。 7 . 将已偶联的树脂倒入一个I c m X l O c m 的玻璃或塑料层析柱，让柱床在重力的作用下 沉积。用> 5 0 m l 的磷酸钾盐/N a C l 溶液清洗柱子。如果柱子不再使用，加入叠氮钠
    并保存在4°C 。 8 . 在使用真正的抗血清进行纯化前，用 P B S 作为样品和相同的洗脱缓冲液做一次模拟 纯化，为抗体的纯化做准备。 本 方 案 为 柱 床 体 积 为 3〜 4m l 的 柱 子 提 供 了 足 够 的 树 脂 ，这 种 体 积 对 每 次 纯 化 1〜2m l 的 抗 血 清 较 适 合 。若 柱 子 能 较 好 的 再 次 均 衡 并 保 存 良 好 ，可 使 用 多 次 。 辅助方案2 巯基化树脂填充的肽亲和层析柱的制备 在使用这个方案前必须减少肽溶液的体积。为了防止肽被再次氧化，避免通气并在 含 有 EDTA的缓冲液中快速进行肽的偶联反应。 材 料 （带V 项 目 见 附 录 1) 二硫键较少的肽（单 元 13. 1) V P E B 尿素或盐酸胍，可选 二 甲 基 亚 砜 （D M S O ) ，可选 Sulfolink (Pierce) 或丙硫基 Sepharose 4B (Amersham Biosciences) 半 胱 氨 酸 （L-Cys或 D/L -C ys的结晶或粉末） V 磷酸钾盐/N a C l溶 液 （若要保存柱子须加叠氮化钠） VPBS, pH7. 5 30m l玻璃陶瓷漏斗或30m l的布氏漏斗 15m l 的带盖离心管 Icm XlO cm 的玻璃或塑料层析柱 1 . 将 5m g 二硫键较少的肽溶于5m l 的 P B E 中。若肽不溶于这种缓冲液，添 加 4m ol/L 的 尿 素 或 盐 酸 胍 。或 将 肽 溶 于 少 量 的 D M S O 再 加 至 P B E ，最 后 D M S O 的浓度 要< 2 0 % 。 2•打开前，摇 动 含 有 Sulfolink或 丙 硫 基 Sepharose 4B 的瓶子，使树脂能够均衡的悬 浮 。取 6〜8m l到 30m l的玻璃陶瓷漏斗或布氏漏斗。真空泵温和地抽提溶剂但要避 免树脂过分干燥。 3 . 用 10〜20m l 的 P B E 洗树脂三遍，每次洗时都要充分搅拌，使树脂的团块分解以促 进再次水合。防止树脂过分干燥。 4 . 用一个刮勺将树脂形成的团块转移到15m l 的离心管中。加 入 肽 溶 液 （步 骤 1 ) 并盖 上盖子。使用搅拌器在室温条件下温和地搅拌30m i n 。将离心管放置在架子上并于 室温条件下搁置l h 。 5 . 加 入 30m g 的半胱氨酸，在室温条件下温和地振荡30m i n 。再将离心管放置在架子上 并于室温条件下搁置l h 。 6 . 将黏结剂倒入一个干净的玻璃漏斗。抽提反应混合液并用1〇 〜20m l 的去离子水洗三 遍 。用等量的磷酸钾盐/N a C l溶液再悬浮树脂。 7 . 将已偶联的树脂倒入一个Icm X lO cm 的玻璃或塑料层析柱，让柱床在重力的作用下 沉积。用> 5 0 m l的磷酸钾盐/N a C l溶液清洗柱子。如果柱子不再使用，加入叠氮钠

    来源：丁香实验

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