用于分裂中期染色体分析的组织样本的器械法破碎和培养

基本方案

1.用无菌解剖器械将组织标本放入含有5 mlHBSS及5倍浓度抗生素的35 mm 培养皿中。室温下放置>30 min。

2.将组织标本转移至一个新的含有约 2 ml 完全培养基/FBS(补充培养基，如 Chang 培养基，单元 8.2 或 IrvineScientific, 可加快生长速度）。用精细解剖剪和精细镊或用解剖刀将组织切碎为细小的碎片。

3.用无菌巴氏吸管将组织碎片和尽可能少量的完全培养基/FBS(每个培养瓶约 Iml) 转入 2 或 3 个 25 cm2 塑料组织培养瓶中，将组织碎片平均分布到整个培养瓶底（最宽的面）。

4.小心将培养瓶直立（底面垂直，盖朝上），旋紧瓶盖，培养数小时或过夜。

5.从培养瓶中组织细胞面的相对面加入 4 ml 完全培养基/FBS，小心操作注意不要搅动贴壁的组织碎片，旋紧瓶盖（防止污染），将培养瓶平放（使组织贴壁的面保持水平），培养 2d。

6.检查植株是否有污染，培养液变混浊、培养液酸性变强或有明显的真菌生长均提示有污染。如果没有污染迹象，将培养瓶盖旋松继续培养。

7.5d 后（至 3 周）检查植株生长情况，如可看到少量细胞，通常为成纤维细胞，在组织碎片周围生长。

羊膜或一些其他组织培养的细胞可为上皮细胞而不是一般情况下的成纤维细胞。这些细胞（包括成纤维细胞）均不耐胰酶，因此若需制备染色体涂片需尽早收获。

8.细胞生长过程中每周更换培养基两次。如果可能的^§冲洗掉大的组织移植片，当数个克隆生长良好且已经进入指数生长期（如有丝分裂细胞呈圆形且游离，克隆间有充足空间）时，可从原代培养直接收获细胞并按照培养瓶培养羊水的方法（单元 8.2) 制备分裂中期染色体涂片。对染色体涂片进行染色（单元 4.3) 并分析核型 (附录 3K)。

备选方案 1 用于分裂中期染色体分析的组织样本的酶裂解法和培养

1.将待检组织分别放入 35 mm培养皿中（每种组织放一个皿）。加入 Iml 胶原酶溶液，消化 lh。

2.用吸管或注射器将含有松解细胞的胶原酶溶液转移至一个 15 ml 无菌离心管中。盖上离心管盖，室温下放置。在培养皿剩余组织中加入 Iml 胰酶/EDTA 溶液，消化 lh。

3.用一个连有 20 G 针头或精细巴氏吸管的注射器上下吹打皿内液体，将仍聚集的细胞团打散。将细胞悬液转移至第 2 步中含有细胞悬液的离心管。

4.加人完全培养基/FBS 至 12 ml。室温下 70 g 离心 8 min。弃去上清，用 1?2 ml 完全培养基/FBS 重悬细胞沉淀。

5.按照羊水培养方法将细胞悬液滴至 4 张盖玻片上或分至两个 25 cm2 培养瓶中培养，Id 后检查有无污染。收获前营养培养，按照原位培养法或培养瓶培养法制备分裂中期染色体涂片（单元 8.2)。对染色体涂片进行染色并分析核型。

支持方案 1 妊娠产物标本的培养

1.将妊娠产物标本置于无菌或干净的密闭容器内运送。

2.若立即处理标本，则不需要加入额外的液体，因为标本本身已含有足够的液体以维持其湿润。若标本不能立即处理，则需在 24 h 内处理，标本于 4°C 保存不得超过 5d。

不要加人额外液体，不可冻存标本。

3a. 对于较大的且完整的标本，若胎儿部分较易辨别，比如整个的或大块碎裂的胚胎，则从容器中小心取出标本的胎儿部分置于一大小合适的塑料无菌培养皿或不锈钢容器中。还应仔细寻找胎盘及胎膜碎片。

注意：虽然大部分样品未灭菌，所以真正的灭菌是不可能的，但是所有培养皿和设备都要清洁并用酒精灭菌。

3b. 对于较小的或部分的标本，则直接将全部样本置于一较大培养皿中。用解剖针或精细镊仔细分离标本，寻找小的胚胎或胚胎部分以及胎盘、胎膜和胳带碎片。

标本中的大部分可能为母体蜕膜，蜕膜组织不能反映胎儿的基因型，因此不能用。悦膜组织外观_^是膜状的，与胎膜相似（如羊膜与绒毛膜），但蜕膜组织非常脆。如果需要可用解剖显微镜观察可疑的胎盘或胚胎组织的碎片以确定它们的来源。胎盘有缄毛分支，可以此区别胎盘与蜕膜。

在较早期且完整的标本中，胚胎组织有可能被完全包裹在绒毛和（或）蜕膜内』则需要切开标本以寻找胚胎组织。

在一些不完整的标本中也有可能无法找到胚胎组织。

4.如果标本为新鲜的未软化的胎儿，则从四肢采集 2~3 mm3 的肌组织进行培养。如果为防止可能存在的嵌合现象而需要从其他器官取材，而皮肤、肾脏、肺脏和（或）肝脏这些器官的组织均可用于培养。如果标本为新鲜的小胚胎，则一次检查或拍照取整个样本的 2~3 mm3 的一部分。如果胚胎或胎儿已软化，则取 2~3 mm3 的胎膜或域毛碎片。

在很多自然流产及部分人工流产中，胚胎或胎儿可能在排出前数天已经死亡，这将导致胚胎标本变色、质脆且质软（已软化），这样的胚胎标本通常不能达到足够数量的活力细胞用于培养。在这种情况下蜕膜组织一二胎膜及绒毛通常更有活力。

支持方案 2 皮肤或其他活检组织标本的培养

无菌操作收集活检组织。用无菌精细镊和精细剪或解剖刀仔细修剪脂肪组织。将活检组织置于含有足以覆盖组织的 HBSS 或无补充培养基的无菌离心管中，如需保存则于 4°C 保存，不可冻存标本。

如需活体取材培养成纤维细胞，通常情况下采取皮肤活检，需采取直径 2 mm、深 2 mm 的皮肤组织。外科手术时则可获得其他来源的组织标本（筋膜或其他结缔组织最易培养）；在某些特殊情况下需要研究一些特殊组织（如性染色体嵌合病例中的性腺组织活检）。这些组织活检需采取约 3 mm3 的一小片。如果是死产或新生儿死亡病例的尸检，则可获得较大部分的组织用于培养。如果没有其他需特别考虑的因素，深部肌肉组织为最佳选择。因为深部肌肉组织较皮肤组织不易被污染，且可以在机体死亡后 5~7d 仍有活力。

标本现在可用于制备分裂中期染色体涂片的培养了。培养 3~4d 后应检查植株向外生长的情况。

绒毛标本直接制备法

从自然流产或人工流产中取得的绒毛组织可用于直接制备分裂中期染色体涂片。从绒毛膜绒毛活检中获取绒毛组织，按照单元 8.1 中的描述直接制备分裂中期染色体涂片。按照单元 4.3 及附录 3K 中的描述进行染色和核型分析。

这样的制备方法不能获得大量的分裂相且质量不高。但比起以上描述的方法，该方法不需大量培养基及很长的培养时间，且不会有因母体来源细胞的过度生长而导致误诊的可能。直接制备法制备的染色体玻片亦可用于间期核原位杂交来筛查一些非整倍体