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    原位培养法对羊水标本的制备、培养、收获和分析

    相关实验：羊水标本的制备、培养和分析实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    羊水
    乙醇 chang 培养基 秋水仙胺 低渗液 甲醛 冰乙酸固定剂 Permount 封固剂
    用于细胞培养的20ml 注射器或试管 15ml 离心管 离心机 盖玻片 巴氏吸管 倒置显微镜 精细镊 蓝垫或纸巾 玻片加热器

    步骤

    1.将羊水置于可用于细胞培养的20m l 注射器或试管中。样品处理前应室温下放置，不 要将样品冻存或置于热环境中，因为极端的温度对细胞生长有害 M 个 孕 周 后 的 羊 膜 腔 穿 刺 可 获 得 的 羊 水 样 本 量 大 约 为 施 丨 ， u 周 之 前 约 为 IOml。 大 致 的 规 律 是 每 增 加 - 个 孕 周 可 多 获 得 _ 羊 水 样 本 。 当 天 处 理 。 2•轻轻混勻含有羊水样本的试管以使细胞悬浮。 3.对于多于ISml的样本，平 均 分 装 至 两 个 ^离 心 管 ； 少 于 旧 的样； ^直 接 转 入
    15ml离 心 管 。 室 温 下 1〇 9尽 离 心 l〇 m in 。 4. 在离心过程中标记好35m m 培养皿的皿盖和皿底。常规羊膜腔穿刺（14〜22个孕 周）获得的羊水样本需用5 个培养皿，过早或过晚的羊膜腔穿刺（ 分别为早于14个 孕周或晚于22个孕周）获得的羊水样本可用4 个培养皿。 5•火焰灭菌并烧干2 2 m m 2 的盖玻片（ 确保完全干燥） ，每个培养皿中放入一个，仅余 最后一个培养皿不放。 6 . 从离心机中取出离心管，小心不要搅动沉淀与离心管底部的细胞。吸去上清，留细 胞沉淀上方约Iml上清液。将上清移入另外的试管4°C 保存以备生化检测。 常规羊膜腔穿刺获得大于15m l 羊水样本的处理 用 〇.7m l 室温下2 0 % Chang培养基轻轻重悬两管细胞沉淀中的一管。轻轻吹打试 管边缘使细胞沉淀重悬。平均分配细胞悬液滴于第一个和第二个培养皿中间的盖玻 片中央。仔细操作，确保细胞悬液滴于盖玻片上。 8a.用 1.2ml室温下2 0 % Chang培养基轻轻重悬第二管细胞沉淀。将细胞悬液平均分 于剩下的三个培养皿中，仍需仔细操作，确保细胞悬液滴于第三个和第四个培养皿 中的盖玻片上。 9a.在第五个培养皿中加入2m l室温下2 0 % Chang培 养 基 （ 单层培养） 。 培养24〜 72h。 过早羊艇腔穿刺所得羊水样本或任何小于15m l 的羊水样本的处理 7b. 如步骤7a，于细胞沉淀中加人I. 6 m l室温下2 0 % Chang培养基，轻轻重悬细胞。 8b.将细胞悬液平均分于4 个培养皿中（ 见第5 步） 。仔细操作，确保在前三个培养皿 中细胞悬液全部滴在盖玻片上。 9b.在第5 个培养皿中加入2 m l 室温下2 0 % Chang培 养 基 （ 单层培养） 。 培养24〜 72h。 过晚羊膜腔穿刺所得羊水样本的处理 7c. 如步骤7a，每个试管中加入〇 .7ml室温下20% Chang培养基，轻轻重悬细胞沉淀。 8c. 将一管中的细胞悬液平均分于第一个和第二个培养皿中，每个皿中均有一盖玻片。 9c.将另一管中的细胞悬液平均分于第三个和第四个培养皿中，.一个皿中有盖玻片， 一 个皿中没有（ 单层培养) 。 单层培养的皿中加入2 m l 室温下2 0 % Chang培养基。培 养 24〜 72h。 10.在有盖玻片的培养皿中加入2m l 预热的20% Chang培养基。培养2d。 11•用连有负压抽吸装置的高压灭菌巴氏吸管吸去培养基。吸管应围绕培养皿周围抽吸 以免搅乱细胞。 12•加入2 m l 预热的2 0 % Chang培养基，继续培养。第一次换液后，基本每周换液一 次。收获当天不要换液，这样就不至于破坏活跃分裂的细胞，使其更少的贴壁。最 好于收获前24〜4 8 h 换液一次以促进细胞更好的生长。如果培养出现特殊的 “junky” 或血染，那么在吸去培养基之前轻轻振荡培养皿。 13.培养第5 天，倒置显微镜下观察原代培养周期中克隆形成情况及细胞生长情况。传 代 24h 后开始检查传代培养情况。
    原 代 细 胞 建 立 在 培 养 第 一 天 。 大 部 分 原 代 培 养 可 于 培 养 5〜9 d 收 获 。 细 胞 培 养 5 d 以 后 克 隆 形 成 ，细 胞 有 丝 分 裂 活 跃 ， 生 长 旺 盛 。 倒 置 显 微 镜 下 可 观 察 到 折 光 性 双 联 体 出 现 。 当 有 显 著 数 量 的 有 丝 分 裂 双 联 体 出 现 在 细 胞 克 隆 的 周 围 且 它 们 之 间 仍 有 足 够 S 间 以 区 分 相 互 独 立 的 克 隆 时 就 可 以 收 获 细 胞 了 （ 支 持 方 案 D 。 14. 每^ 皿中加入SOWlOmg/m l秋水仙胺^轻轻转动培养皿混勻。孵 育 2〇min。 15. ' 从培养中取出培养皿，沿培养皿内缘轻轻加入lmi 低渗液。放 置 1〇 〜12min。 16. 用巴氏吸管沿培养皿边缘小心吸去低渗液及培养基混合液。如第15 步 ，再加入2ml 低渗液，放 置 12min。 17. 沿培养皿内缘轻轻加入Im l新鲜配制6 : 1 固定剂，放 置 1〇min。然后沿培养皿边 缘小心吸去固定液及低渗液混合液。 18. 加 入 2m l新鲜配制3 : 1 固定剂。固定12min 后吸去固定剂。重复该方案2 或 3 次， 每次固定lOmin。最后不要移去固定剂。 19•用精细镊从培养皿中取出盖玻片，用吸水纸巾沿盖玻片边缘吸去盖玻片上多余的固 定剂。^吹盖玻片细胞面。将 盖 玻片倾斜（ 细胞面朝上） ， 靠 在 3 5 m m 培养皿盖的 边上，培养皿盖则放在湿的蓝垫或湿的纸巾上，以便在干燥处理开始前维持湿润环 境 （ 图 8. 2.1. A)。在湿垫或纸巾上放置2〜3min。20.将盖玻片倾(细胞面朝上） ，靠在35m m 培养皿盖的边上，置于6( T C 玻片加热器 上直至玻片干燥（ 约 l〇 min)。当玻片完全干燥时，用拇指和食指夹住玻片，用红 色绘图铅笔轻轻在玻片背面做标记。 21. 盖玻片细胞面朝上倾斜放置于60°C玻片加热器上至少让，但不能超过24h。立 即 以 G T G 显带或在显带前室温下放置，放置时间不超过2 周 。 22. 用标准方法及时间在染缸中对盖玻片进行染色（ 单元4.3)。参照第一次G T G 显带 的指导说明，用 0.025% C m A O 胰酶消化1.5〜2m in， 4 % (m /V ) 吉姆萨染液染 色 5- min。.

    如果发现异常细胞 26b ’^ 查同—克隆其他分裂相。如果其他分裂相均正常，选择至少两张盖玻片总 数^ 2 个克隆，分 析 5 个中期分裂相。 27b . 将 这 5 个中期分裂相拍照，并对两个中期分裂相进行核型分析。 ^ 果发现一个异常细胞且在同一个克隆内没有其他分裂相或同一个克隆内所 有为裂相均为同样的异常（ 非 嵌 合 ） 26c•检查其他克隆有无该异常。 如果所有克隆内都存在相同异常的 细 胞 （ 培 养 无 嵌 合 ） 26d• ，择至少两张盖玻片总共计数1〇个 克 隆 （ 或相当于1〇个 的 嫌 ） ，分 析 $ 个 分裂相。 27d. 将 这 5 个中期分裂相拍照，并对两个中期分裂相进行核型分析。 如果仅有部分克隆内存在异常细胞（ 培养有嵌合） 26e.选择至少两张盖玻片总共计数20个 克 隆 （ 或相当于20个的克隆） ，分 析 5 个中期 分 ^ 相 （ 一个细胞株分析两个分裂相，另一个细胞株分析三个分裂相） 。 27己 2 这 5 个中期分裂相拍照，并对两个中期分裂相进行核型分析（ 每个细胞株一 I /O 上 如 果 在 两 个 或 更 多 的 培 养 m 中 发 现 同 样 的 异 常 则 诊 断 为 真 性 嵌 合 体 （ 例 如 ， 原 养 法 中 的 组 织 培 养 孤 或 培 养 瓶 培 养 法 中 的 培 养 瓶 ，见 备 选 方 案 D ，如 果 “ 种 t 常 仅 在 一 个 培 养 皿 中 发 现 ， 即 便 是 在 原 位 培 养 时 该 异 常 存 在 于 不 同 的 克 隆 中 ， 也 诊 断 为 假 性 嵌 合 体 ， 因 为 有 丝 分 裂 的 细 胞 不 贴 壁 ， 所 以 可 以 在 培 养 孤 ^ 其 他 克 隆 。 支持方案1 溴化乙锭法高分辨染色体显带的收获 欠#该方法用于获得比标准收获方法更长的分裂中期染色体（ 常规方法染色体可显500 该方法可显800条带） 。更多的条带可用于鉴别更加微小的染色体异常，但更长 体不宜分散，且更容易与其他的染色体交叉重 叠 。 为了更加全 可 种 方法同时收获细胞。 』用 网 附加材料（ 标V 的条目参见附录1) 已培养好的细胞（ 基本方案） V 〇’5m g / m l溴 化 乙 锭 （EB)
    1.在准备收获（ 如基本方案第13步）的培养血中加人25W 0.5m g /m 丨溴化乙锭（EB)， 孵育70min。 2 . 加入50jull〇 m g/ml秋水仙胺，孵育20min。 3. 从基本方案第15步开始收获细胞。 支持方案2 单层细胞培养的细胞传代 如果从盖玻片上收获的细胞数暈不足以进行分裂中期染色体分析，可将单层贴壁培 养的细胞传代至新的盖玻片，从传代细胞获得更多的有丝分裂相。 附加材料（ 标V 的条目参见附录1) 可供传代的单层贴壁培养细胞（ 基本方案） V 无 钙 无 镁 H B S S ， 37°C 胰酶/E D T A 溶液： 0.05% (m /V ) 胰酶/O.53m m o l / L E D T A . 4Na (Life T e c h - nologies) , 37〇C I. 倒置显微镜下扫描待传代的单层细胞（ 如基本方案第l〇 a 、 10b 、 10c 步） 。放 大 40 倍时一个视野的细胞足以覆盖一张盖玻片，由此计算确定待传代的单层细胞所需用 的盖玻片数量。 若 单 层 细 胞 仅 有 一 个 克 隆 则 不 进 行 传 代 ， 除 非 该 克 隆 的 大 小 恰 好 合 适 传 代 至 一 张 玻 片 上 （ 如 布 满 显 微 镜 4 0 倍 一 个 视 野 ） 。 2. 将灭菌且完全干燥的盖玻片置于标记过的35m m 培养皿中。 3 . 吸去培养皿中的培养基。用 2m l 预 热 H B S S 洗涤细胞以完全去除培养基。 4. 吸去H B S S ，加入0.5m l 预热的胰酶/ E D T A 溶液，孵育3〜4min。 5•倒置显微镜下观察细胞游离情况，细胞应变为圆形且呈漂浮状态。如果所有细胞均 未游离，敲击培养皿底部，若细胞仍未游离，则多孵育lmin。 6. 加入足量已预热2 0 % C h a n g 培养基使每个皿中达到〇.5m l 液体。用吸管上下吹打细 胞以打散细胞团。 ~ 7. 每个盖玻片上滴0. 5m l 细胞悬液，在原代单层细胞上加人2m l 已预热2〇% chang培 . 养基。 & 所有培养皿至少培养2h。若传代进行较晚，则培养过夜。 9•在含有盖玻片的培养皿中加入2m l 已预热20% Chang培养基。 如果用25cm2 培养瓶进行传代培养，则 需 要 ― 细 胞 悬 液 。一个狐 中 已 铺满的 f 心孜且平铺于取终体积的培养基中 ， 至—个 25^ 培 养 瓶 中 ， 因 为 它 （ 支持方案 们将利用整个容器的底部作为生长表面。 3)。培养瓶培养细胞时细胞应为 备选方案培养瓶培养法对羊水标本的制备、培养、收获和分析 " U 方法较原位j ：口养法需较长时间， 但由于培养基较多，因此可获得更多的分裂相。 附 加 材 料 （ 参见 基 本 方案） 膜酶/E D T A 、溶液： 0.05% (W ) 胰酶/0. 5 3 m m o l / L E D T A 4Na (Life Tech
    1•将羊水标本转移至15m l 离心管，按照基本方案中第1〜3 步进行离心。 2.离心时标记25cm2 培养瓶。常规羊膜腔穿刺（14〜22孕周）获得的羊水样本需用3 个培养瓶，过早或过晚的羊膜腔穿刺（ 分别为早于14孕周或晚于22孕周）获得的 羊水样本可用两个培养瓶。 3. 从离心机中取出离心管时注意不要搅乱细胞沉淀。吸去每个离心管中的上清，留约Iml 液体于细胞沉淀上。将上清转移至其他试管以备生化检测（ 检测A F P 需 4°C 保存)。 4. 如果液体分至两个离心管，则用3m l 已预热的20% Chang培养基将第一管细胞沉淀 重悬，轻轻敲击离心管边缘使细胞沉淀悬浮，然后将第一管的细胞悬液转入第二管， 重悬第二管细胞沉淀。若液体仅有一管，则用3m l 已预热的20% Chang培养基重悬 细胞沉淀，轻轻敲击离心管边缘使细胞沉淀悬浮。 5•将细胞悬液平均分至培养瓶中。加入已预热的20% Chang培养基使每个培养瓶中液 体终体积为5ml。培养4〜6d。 6. 用连有负压抽吸装置的高压灭菌巴氏吸管吸去培养基。倾斜培养瓶，使吸管置于培 养瓶一角吸去培养基以免搅动细胞。 7 . 在培养瓶中加入5m l 已预热的20% Chang培养基继续培养。尽量不触动培养瓶，但 至少每周更换一次培养基（ 当培养基变黄时） 。 8. 培养5〜6d 后应定期于倒置显微镜下观察细胞生长情况。当有显著数量的有丝分裂 双联体出现在细胞克隆的周围，且它们之间仍有足够空间以区分相互独立的克隆时 就可以收获细胞了（ 通常为6〜12d)。如果培养瓶细胞生长过于旺盛，则可将细胞传 代至多个培养瓶中（ 支持方案3)。 9 . 收获前12〜 22h 营养培养。准备收获细胞时，每个培养瓶中加入loo— l〇 m g/m l秋 水仙胺，孵育20min。 不要将一个样本所有的培养瓶全部用于收获。始终保留一瓶 备用以便当需要更多材料时可用于传代。 1〇•从培养瓶中吸去培养基。用 2m l 预热的胰酶/E D T A 溶液洗涤培养瓶彻底去除培养 基，将洗脱液置于一个15m l 离心管中以备第14步所用。 11.在培养瓶中再加入2m l 预热的胰酶/ E D T A 溶液，孵育5min。 12•倒置显微镜下观察细胞游离情况，细胞应变为圆形且呈漂浮状态。如果所有细胞均 未游离，敲击培养瓶底部，若细胞仍未游离，则多孵育5min。 . I3. 加入2 m l 已预热的2 0 % C h ang培养基洗刷培养瓶表面细胞。用吸管上下吹打细胞 以打散细胞团。 14•将细胞悬液转入含有2m l 第 10步中洗涤培养瓶的胰酶/E D T A 溶液的离心管中，室 温下l〇9g 离心lOmin。. 15•离心细胞后，倒 去 上 清 （ 或小心吸去） ，仅 留少量液体（ <〇. 5ml) 以重悬细胞 沉淀。 16• —滴一滴地加入Iml预热低渗液，使液体缓慢滑人管底。轻轻敲击以混匀。然后再 加 6m l 预热低渗液，在低渗液与细胞混悬液接触前仍应使液体缓慢滑入管底。盖上 离心管盖，.培养10min。
    17, 加 入 5 滴新鲜配制3 : 1 固定剂，轻轻倒转离心管以混匀。室温下70尽离心lOmin。 18. 倒去或小心吸去上清， 一 滴一滴地加人Iml 3 : 1 固定剂，使其缓慢流人管底。轻 轻重悬细胞沉淀，小心不要让细胞在离心管内飞溅。 I 9•加入6ml 3 : 1 固定剂，使 其 缓慢 流 入 管 底 。盖 上 离 心 管 盖 ，一 2〇°C 冻存超 过 30m in。 20.70^离心l 〇 min。移去上清，再加入7m l3 : 1 固定剂。第 Im l应一滴一滴缓慢加入， 轻轻混匀，然后再加人剩余的6m l。 21. 重复第20步，更换固定剂3 或 4 次 （ 对于那些培养中可看到碎片或以前制备的分 裂相周围胞质未除净，于染色体周围着色者)。 22. 最后一次更换固定剂后余少量固定剂以重悬细胞沉淀（ 通常约为〇.5m l) 以使滴片 的细胞悬液达到预期的浓度（ 单 元 4.1)。 23.每个培养瓶的细胞制备3〜5 张玻片，每张玻片10〜3〇个分裂相， G T G 显带法进 行 染 色 （ 单元4.1和单元4. 3)。按照指导说明，第一次显带时在0.025% (m A 〇 胰酶中消化1. 5〜2min，在 4 % (m /V ) 吉姆萨染液中染色5min。 24. 开始分析第一张玻片。选择染色体分散良好且比较完整（ 如绝大部分应该具齐46 条染色体）的细胞进行计数。 如果没有发现异常细胞 25a. 计数20个细胞，理想情况下应2 个培养瓶各计数1〇个细胞。显微镜下分析5 个分 裂相。如果羊水样本体积> 1 6 ml，则应排除那些在9 5 % 的可信区间内嵌合程度大 于 2 0 % 的细胞。 26a. 将 这 5 个中期分裂相拍照，并对一个中期分裂相进行核型分析，见基本方案第26、 27步 ，用于核型鉴定及讨论。 如果在所有细胞中均发现同一异常 25b. 计 数 10个细胞，至少计数一个来自第二个培养瓶中的细胞。分 析 5 个分裂相。 26b. 将 这 5 个中期分裂相拍照，并对一个中期分裂相进行核型分析。 如果仅发现一个核型有数目异常 25c. 收获第三个培养瓶培养的细胞，在没有发现该异常的两个培养瓶中计数2〇个中期 分裂相。分 析 5 个 分 裂 相 （ 一个细胞株分析两个分裂相， 另 一 个 细胞株分析三 分裂相） 。 如 果 在 这 两 个 培 养 瓶 培 养 的 细 胞 中 均 没 有 发 现 该 异 常 ， 则 结 果 应 解 释 为 假 性 嵌 合 或 培 养 过 程 中 人 为 原 因 造 成 。 如 果 这 两 个 培 养 瓶 培 养 的 细 胞 中 有 一 个 也 发 现 了 该 异 常 ， 则 解 释 为 真 性 嵌 合 。 26c. 将分析过的分裂相拍照并在每个细胞株选取一个核型进行核型分析 如果仅发现一个核型有结构异常 25d. 在第二瓶细胞中计数20个细胞，注意有无该异常。分析5 个分裂相（ 一个细胞株
    分析两个分裂相，另一个细胞株分析三个分裂相） 。 如 果 在 第 二 瓶 细 胞 中 没 有 发 现 该 异 常 ， 则 结 果 应 解 释 为 假 性 嵌 合 。 如 果 第 二 瓶 细 胞 中 也 发 现 了 该 种 异 常 ，则 结 果 应 解 释 为 真 性 嵌 合 。 26d. 对每个细胞株中的5 个分裂相拍照，每个细胞株选取—个核型进行核型分析。 支持方案3 培养瓶培养细胞的传代 1 . 当培养细胞已生长至足以传代，铺满或接近铺满培养瓶（ 备选方案，第 8 弗） 附丰 培养瓶中培养基。 ^ ’ 2. 用 2m l 预热的胰酶/ E D T A 溶液洗涤培养瓶彻底去除培养基，以免培养基影响膜酶活 性 ，将洗脱液置于一个15m l 离心管中。 3. 在培养瓶中加入2m l预热的胰酶/E D T A 溶液，孵 育 5min 。 4. 倒置显微镜下观察细胞游离情况，细胞应变为圆形且呈漂浮状态。如果所有细胞均 未游离，敲击培养瓶底部，若细胞仍未游离，则多孵育5m in。 5. 加 入 2m l已预热20% Chang培养基洗刷培养瓶表面细胞。用吸管上下吹打细胞以打 散细胞团。 ~ 6. 将细胞悬液转人含有2m l前面步骤中用于洗涤培养瓶的胰酶/E D T A 溶 液 的 禽 管 中，室温下l 〇9g•离心lOm in。 7•倒去上清（ 或小心吸去） ，用 预热20% Chang培养基重悬细胞。重悬细胞所需加人 的培养基体积视需要传代多少个培养瓶而定。 8. 培养细胞，按照备选方案第8〜26 步收获细胞。 参考文献： H s u M a Z . ， 1992 编者： Patricia M inehart M iron

    来源：丁香实验

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