培养法制备绒毛分裂中期染色体涂片实验

基本方案

1.在倒置相差显微镜下用灭菌瓦氏精细镊从母源蜕膜中仔细分离出绒毛。将绒毛转入 HBSS 中清洗，更换 HBSS 直至绒毛洗净。将绒毛分为两部分，一部分用于培养 (第 2 步），其余用于直接制备（备选方案，第 1 步)。

2.将切细和洗净的绒毛 4~10 mg 转入含有 4 ml 胰酶/EDTA/HBSS 溶液的 4.5 ml 灭菌冷试管中。于摇床试管混合器上 37°C 孵育 60 min。室温下 800 g 离心 5 min。

3.轻轻吸去胰酶溶液。加入 1.5~2 ml 的胶原蛋白酶溶液，于摇床试管混合器上 37°C 孵育 30 min。

4.室温下 800 g 离心 5 min。轻轻吸去胶原蛋白酶溶液，余约 0.5 ml 于试管中。

5.用巴斯德吸管 (巴氏吸管）轻轻吹打域毛及剩余胶原蛋白酶溶液 10 次，将绒毛吹打成单个细胞悬液。在悬液中加人 3ml 预热的 chang 原位培养基。

6.将 0.5 ml 单细胞悬液置于火焰灭菌的盖玻片表面，放入 2~6 个标记过的 35mm 塑料细菌培养皿中。如果盖玻片上的细胞悬液过浓（倒置显微镜下观察），用 chang 原位培养基稀释。培养 24 h。

7.每个皿中加入 2ml Chang 原位培养基，培养至细胞贴于盖玻片上（2~3d)。

8.细胞贴于盖玻片上之后，吸去培养基，加入 2ml 新鲜 chang 原位培养基，继续培养。

最好的培养结果是仅仅从间质中心得到培养。如果. 有过多的碎片或母源细胞污染（悬浮细胞），则盖玻片必须小心移入另外一个含 2 ml Chang 原位培养基中。

1~2d 后会出现类似于巢状的成纤维细胞克隆，5~7d 的平皿培养后盖玻片就可以准备收获了，这取决于细胞生长和有丝分裂的活性（如克隆的数量和大小及分裂细胞的数量）。

9.每个皿中加入 10 ul 秋水仙胺，孵育 lh。从皿中移去培养基，加入 3 ml 预热的以枸橡酸納。鮮育 20 min。

10.在皿中小心加入 2 ml 4°C 新鲜配制的固定剂，室温下放置 2 min。

11.吸去枸橼酸钠/固定剂溶液，再次加人 2 ml 4°C 新鲜配制固定剂。放置 20 min。再重复固定两次，第一次固定 20 min，第二次固定 10 min。

12.吸去固定剂，除去多余液体，立即干燥盖玻片。将盖玻片表面暴露于热气中 1~3s。立即将盖玻片表面置于空气泵栗出的柔和气流中。如需要可以观察盖玻片表面以保证均勻干燥及调整气流。

盖玻片的正确干燥是整个实验成功的关键。

13.倒置显微镜下观察盖玻片，判断染色体分散的程度。如需要可调整干燥程序以便得到更好的分裂相。

14.用胰酶-吉姆萨显带法对染色体染色。

15.对 7~10 个中期分裂相拍照分析，对 2 个中期分裂相拍照并进行核型分析（附录 3K)

备选方案 直接法制备绒毛分裂中期染色体涂片

中期分裂相涂片可从滋养层细胞（细胞滋养层的郎格汉斯细胞）自发的有丝分裂或经过有限周期（如仅仅数小时）培养的滋养层获得。

1.将培养法中没有用到的剩余绒毛放入盛有 3 ml 已预热至 37°C 的完全 RPMI/含 1% 庆大霉素的 20%FBS 的培养皿中。培养 3 h 以上（绝不能少于 3 h)。

2.加入 lO mmol/L 的 FUdR(终浓度 3.3X10^-7mol/L)0.1 ml 使培养同步化。培养 15~17 h。

3.加入 lmmol/L 的胸腺嘧啶核苷（终浓度 3.3X10^-5mol/L)0.1 ml。培养 5 h(如果对分裂中期收获率无不利影响，在胸腺嘧啶核苷中培养的时间可以 3~8 h 不等）。

4.加入秋水仙胺使其终浓度为 0.5ug/ml，孵育 2 h。从培养箱中取出培养皿，用巴氏吸管轻轻吸去培养基。

5.缓慢加人 3 ml 37°C1% 枸橼酸钠，孵育 20 min。小心加人0.5 ml 4°C 固定剂终止枸橼酸钠的低渗作用。

6.吸去枸橼酸钠/固定剂溶液，加入 2 ml4°C 新鲜配制固定剂。摇晃培养皿冲洗绒毛，吸去固定剂。再加人 2 ml 固定剂置于冰箱中过夜（如需 24 h 内出结果则置于冰箱中 20 min)。

7.移去固定剂并于室温下放置 1~2 min，使残余固定剂蒸发。

8.加入 100~200 ul 60% 冰乙酸。于倒置相差显微镜下观察细胞从绒毛中释放的情况。

轻柔振荡。当细胞的释放非常明显（单个细胞从组织中游离）时即可制片。检查单个漂浮细胞的数量。

用涂布器制片

9a. 将一张标记好的玻片置于已达到 45°C 的玻片加热装置的表面。滴 100ul 混合好的细胞悬液于玻片上，用涂布器轻轻将细胞悬液涂布于整个玻片。

10a. 不用涂布爭涂布玻片表面，用另一只手缓慢移动玻片，涂布器就可以使细胞悬液沿着玻片轴方向分散覆盖玻片中心 50%~60% 的区域。来回重复 3~5 次，每个来回 30~60s(共 3~5 min)，使细胞悬液充分铺开且干燥。

11a. 从玻片加热装置上取出玻片，从玻片边缘吸干残余液体。在倒置显微镜下观察分裂相分散铺片情况。玻片染色前于 65°C 恒温箱中过夜或 90°C 恒温箱中 10 min(第 12 步)。

用制片机制片

9b. 将制片机温度调至 45°C，将标记好的玻片置于玻片架上。每张玻片上滴 100ul 混合好的细胞悬液，下降梳齿（制片机一次可制 6 张玻片）。

10b. 运行制片机 4~5 min。取出玻片，从玻片边缘吸干残余液体。在相差显微镜下观察分裂相分散铺片情况。玻片染色前于 65°C 恒温箱中过夜或 90°C 恒温箱中 lOmin。

进行第 12 步。

12.用胰酶-吉姆萨显带法对染色体染色（单元 4.3)。对 7~10 个中期分裂象进行结果分析。