基本方案1 毛细管电泳的样品准备

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

5'-FAM 荧光素标记的正向引物 5'-HEX 荧光素标记的反向引物
dNTP 10 X PCR 缓冲液 DNA 聚合酶 Milli-Q 系列超纯水 MgSO4 琼脂糖凝胶基因扫描胶遗传分析仪缓冲液甘油溶液去离子甲酰胺 NaOH DNA 大小标准品
PCR 管热循环器聚丙烯管遗传分析仪

步骤

1.计算P C R 引物的理论Tm 值。用软件或通用的标准计算。用下面的退火温度： Tm (理论）一5°C 。 2. 准备5 个 25m l 的 P C R 反应体系，在冰水混合物中混合下列物质（乘以5): I. 25/J 20； xm〇 l/L 5卞A M 荧光素标记的正向引物（最终稀释为ljumol/L) 1.25pJ 2(V m d / L 5'H E X 荧光素标记的反向引物（最终稀释为 0 • (每种 10mmol/L ) dNTP (最终稀释为 200pmol/L ) 2. 54 10X P C R 缓冲液（最终稀释为I X ) 0. IjlJ 5U / W D N A 聚合酶（最终稀释为 0. 5U /25jul)。 3. 准备5 个 0.2ml P C R 管，在冰水混合物中将下列物质分别加入到标记的管中。 a. IjuI 20 〜 60ng/V 基因组 D N A ， 17. 9/J milli-Q 系列超纯水，〇.5yl 25 mmol/L M g S O 4; b. Ijul 20 〜 60ng/V 基因组 D N A ， 17. 4/J milli-Q 系列超纯水， I.Oyl 25 mmol/L M g S O 4; c. Ipl 20 〜 60ng/V 基因组 D N A ， 16. 系列超纯水， 1. 54 25 mmol/L M g S O 4； d lpl 20〜 60叩 /4基因组 D N A ， 1 6 . milli-Q 系列超纯水， 2.〇 W 25 mmol/L M g S O 4; e. 1M120〜eOng/jul 基因组 D N A ， 15. 系列超纯水， 2. 54 25 mmol/L T MgSO4o 4. 加 5. 6 4 的 P C R 反应混合物到每个0. 2m l 的 P C R 管。制冷。保存在冰水混合物中。 5.用下面设定程序的热循环仪扩增D N A 片段。 1 个循环： 4min 94°C (变性） 34个循环： 20s 94°C (变性） 20s x°C (理论 T tn值一5°C ; 退火） 40s 72°C (延伸） 1 个循环： 7min 72°C (延伸）将热循环仪的盖子打开启动热循环仪，在热盖的温度>85°C 时，尽快将P C R 管从冰水浴中转移到热盖上。关上热循环仪的盖子。 6. 用 2 % 的琼脂糖凝胶通过琼脂糖凝胶电泳分析IOjUl P C R 产物（附录3G )，选择能够使正常片段大小的带清晰显现的MgSO4 浓度。 7. 准备48个 25jlJ P C R 反应体系。在冰水浴中混合下列物质： I. 25W ZOjumol/L 5卞A M 荧光素标记的正向引物（最终稀释为1/xmol/L ); I. 25^ 20/^mol/L 5 ' H E X 荧光素标记的反向引物（最终稀释为ljumol/L);

0.5/J (每种 10mmol/L) dNTP (最终稀释为 200jumol/L); 2. 5jl J IOXPCR缓冲液（最终稀释为I X ); 0. 5〜2. 5jnl 25mmol/L MgS〇 4 (最终稀释为〇.5〜2. 5mmol/L); 15. 9〜17. milli-Q系列超纯水； 0. Ipl 5U/jul Ptw DNA 聚合酶（最终稀释为 0. 5U/25/X 1)。混合好后，分装24jul到〇.2ml PCR管中，加 M 20〜IOOng 基因组DNA, 保存在冰中。 8 . 以第5 步设定好的温度用热循环仪扩增DNA片段。将热循环仪的盖子打开启动热循环仪，在热盖的温度>85°C 时，尽快将P C R 管从冰水浴中转移到热盖上。关上热循环仪的盖子。 9. 用 2 % 的琼脂糖凝胶通过琼脂糖凝胶电泳分析IOjul P C R 产物(附录 3 G ) 。 10. 将下列物质加人到50m l 聚丙烯管中： 3.56g 7 % 基因扫描胶； 5004 IOX带有EDTA或 T B E 的基因分析缓冲液； 2 8 7 ^ 8 7 % 甘油。 l l • 混合 l^ a P C R 产物（ 0 . 1 〜 0 .5 J u g / V lD N A ) 、 1 0 ^ a 去离子甲酰胺、 0 .5 J L a 0 .3 m o l/L N a O H 和 0. 5julD N A marker。 12.卩01产物在95°(：变性 5111丨 11，将混合物冷却至4°(： (或者变性后转入到冰水混合物中）。

来源：丁香实验

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