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通过质体融合将完整的 YAC 导入哺乳动物细胞

最新修订时间：

材料与仪器

靶细胞：培养的贴壁生长的哺乳动物细胞 带有以neo（G418-resistance)为筛选标记的 YAC 的酵母菌株
山梨糖醇 SCE 溶液 ST 溶液 EDTA 小鼠 Cot-1 DNA
SD dropout 培养基和培养板 合适的放射性标记的探针 直径 100 mm 培养皿和 24 孔组织培养板 15 ml 带盖玻璃培养管 恒温箱 离心机 相差显微镜 水浴锅

步骤

1. 开始扩增哺乳动物细胞，在开始约3d 内 I O O m m 组织培养板中的细胞会合度达到 9 0 % ，细胞数量达到IO7 (足够5 次融合，每扩增2 XlO6个细胞融合一次） 。 2. 在细胞达到9〇%会合度前两天，将带有n m 标记Y A C 的酵母单克隆接种到盛有5ml SEKJm-Trp-His培养基的15m l 玻璃培养管中。 30°C 转鼓孵育过夜。 3•第二天，将第二步所得酵母培养物接种到盛有100ml SDAJra-Trp-His培养基的 500ml Erienmeyer培养瓶中。 30°C 剧烈摇动培养过夜
4•在进行融合的当天早晨，添 加 25m l 新 鲜 SEMJra-Trp-His培养基到酵母培养物中 30°C剧烈摇动I.5h 或 0 D _ 达 到 1. 2〜1. 5。 5 . 将酵母培养物分装至4 个 50m l尖底离心管，室 温下500g 离 心 5min (2000r/min， Beckman TH-4转子） 。用 5ml lmol/L 山梨糖醇重悬沉淀物，将重悬的细胞倒入一个 5 0 m l 尖端离心管。 6. 再次以500g 离 心 5min，去除上清液。加 人 20ml lmol/L 山梨糖醇， 500g 离心 5min，去除上清液。用 20ml S C E 溶液重悬细胞，力口入IOOjuI 20m g /m l 藤黄节杆菌 酶 20T 。 30°C 孵育 30min。 7. 在盖玻片上滴IOjul 10% S D S 加 人 IOjul细胞悬液。用相差显微镜检查球形体的形成。 溶解了的球形体呈灰暗细胞形骸；不能溶解的细胞（ 如未去壁细胞）则具有高度回 缩性。 8. 继续3〇° C孵育，每 1 0 〜15min检测一次球形体形成情况，直到8 5 % 〜9 5 % 的细胞去 细胞壁。 从 此 时 起 ， 必 须 密 切 关 注 以 免 脆 弱 的 球 形 体 细 胞 裂 解 ， 必 须 极 慢 极 轻 地 摇 动 Ih 以 重 悬 。 9. 4°C以 250发离心球形体7min (1000r/min， Beckman T H -4转子） 。倒去上清液，加人 20ml S T 溶液洗细胞，极慢极轻地摇动重悬沉淀物。重复洗一次以i〇 m lS T 溶液轻 轻重悬。 10. 将球 形 体 悬 液 加 入 99(^1 S T 溶液中并用血细胞计数器（ 附 录 31)计数。如有 需要，可用S T 溶液将球形体悬液稀释至〇.8 X IO8〜I.4 X IO8个球形体/ml。将球 形体置冰上，为保持其悬浮状态，每 5〜IOmin轻摇一次。 11. 每 个 IOOmrn培养皿加人5ml P B S 洗哺乳动物靶细胞，共 2 次。加 入 Im l胰酶/H> TA ， 37° C 孵育直至细胞由培养皿上脱落。用 12〜U m l加血清的完全培养基重悬 约 IO7 个细胞并转移到一个15m l离心管中。血细胞计数器进行细胞计数确定细胞 浓 度 （ 附录31)。 12. 4°C 25Og•离心靶细胞3min，用无血清培养基重悬至2XIO6 个细胞/m l。每一次融 合 作 用 （ 至 少 4 次 以 形 成 PEG 处理的时程变化） ，将 Im l重悬细胞转移到一个 E m l离心管， 250g 离 心 3min，不要将上清液倒出。 13. 将 IXlO8 S T 溶液重悬的球形体加到上清液顶部。 250g 离 心 3min后小心吸去上清 剩 余 50〜IOOjuI 培养基。用剩余液体轻轻研磨沉淀物，以充分重悬细 胞 。 14. 加 人 2ml 50% PEG 1500并通过使用5m l移液管轻轻吹打3 次以混匀。混匀后，立 刻开始计时融合的时间。 最 佳 PEG 处 理 时 间 因 细 胞 系 而 异 ，要 靠 摸 索 出 的 经 验 确 定 ；每 组 融 合 反 应 均 应 设 置 一 个 处 理 时 程 ，分 别 进 行 3 0 、 6 0 、 9 0 或 120s 的 融 合 反 应 。 15. 在反应结束时，加 人 5m l无血清培养基，轻颠倒3 次， 250g 离心3min，用加血清的 完全培养基轻轻重悬沉淀物，以 2X IO5〜5XIO5 个细胞/皿的密度将融合细胞接种 到4〜10个 I 〇〇m m 组织培养皿中。 接 种 皿 的 数 量 和 接 种 细 胞 的 数 量 由 有 细 胞 生 长 率 和 G 4 1 8 杀 死 敏 感 细 胞 所 需 的 时 间 决 定 。接 种 密 度 应 足 够 低 ， 以 至 在 G 4 1 8 杀 灭 敏 感 细 胞 之 前 ， m 中 细 胞 不 会 过 度 生长。
16. 在融合后12〜18h ，用加有200〜8 ( % g/m l G 418 (因细胞类型而异）含血清的完全 培养基给细胞换液。持续用含血清和G 418的完全培养基培养8〜U d , 直到大多数 细胞死亡，而 G 418抗 性 （ 如 n e o O 克隆出现。 17. 用 cloning cylinders将单克隆分别转入加了含血清和G 418的完全培养基的24孔组 织培养板的一个孔中。对于胚胎干细胞（embryonic stem cell, ES-cell) 的融合反 应来说，挑几十个克隆有助于减少大部分细胞在亚克隆化时死亡的风险和扩增未经 分化的细胞。扩增细胞用于冻存和D N A 分析。 18. 从单个G 418抗性克隆扩增的大约IO6个细胞中提取D N A (附录3A )。 19. 用表5. 3.1中的引物P C R 扩增检测U R A 3 和neo筛选标记的有无，连同作为对照 的各克隆亲代酵母菌株D N A 中Y A C 的有无分析各克隆的细胞。使用如下的PCR 循环参数。 3 0 个循环： l m i n 9 5 °C Imin 6 0 0C 2 min 7 2 〇C 20. 通过P C R 扩增，或者通过琼脂糖凝胶电泳结合用合适放射性标记D N A 探针进行的 Southern印迹杂交（Southern blot hybridization; 附录3G ) 来确定有无已知基因 或 Y A C 上的标记。煮沸IOmin后冰上冷却lmin。 65°C 孵育lOmin。将预变性探针 加人杂交缓冲液进而进行Southern印迹杂交分析。 21.制 备 “A & 图谱’’（A h profiles) (为了确定Y A C 的完整性） 。用几种限制性内切核 酸酶酶切第18步制备的各克隆细胞D N A 、 Southern印迹、用人A h 探针探测样品 中跨Y A C 的片段。 A h 探针与小鼠重复D N A 预退火。反应体系： 5 0 ng 探针 D N A ; IOOjug 小鼠 Cot-1 D N A ; 2 5 jul 2 0 X S S C ； 加水至1004。 煮沸IOmin后冰上冷却lmin。 65°C 孵育10min。将预变性探针加人杂交缓冲液中进 而进行Southern印迹杂交分析。 ， 22. 通过与酵母T y 重复元件探针Southern印迹杂交确定酵母D N A 的有无（ T y 阳性限 制性片段的数目提供了一个存在于细胞中酵母量的信息指示） 。 23.从细胞系中制备中期伸展分裂相（ 单 元 8. 2)、染 色 体 带 （ 单 元 4.3 ) 和核型分析 (附录3K )。 备选方案使用脂质体将胶纯化的YAC D N A 引入哺乳动物细胞 附加材料（ 见基本方案1 ; 标V 的条目参见附录1) 含带有M O 筛选标记的完整Y A C D N A (支持方案1 ) 的 P F G E 胶 条 （ 基本方案2) V 透析缓冲液I lU/yl 琼 脂 水 解 酶 （N e w England Biolabs) Lipofectin (Life Techologies) 或 其 他 可 用 于 D N A 转 染 的 阳 离 子 脂 质 体 （ 如
Transfectam Promega) 用于优化脂转效率的阳性对照DNA (可在靶细胞中表达的neo1 ■标记质粒，如 pDC47) ’ 40°C 和 65°C 水浴 35m m 组织培养皿 5m l 聚苯乙烯管 1. 将含Y A C 的 P F G E 胶条放人50m l 圆锥管，加 入 30〜40m l 透析液在4°C 透析10〜 12h ，其间换透析液3 次。 2. 倒出透析液，将胶条切成〇.5〜2. Oml的片段，放人离心管。在 65°C水浴至琼脂糖 完全融解， 40°C平 衡 5min。 3 . 加人I O U 卩-琼脂水解酶，并轻轻吹打混匀。 40°C 孵 育 60〜120min至琼脂糖融化完 全。将离心管置于冰上，查看有无琼脂凝块。如仍有凝块存在，再次在65°C 熔胶， 然后冷却到40°C ，再加入I O U 卩-琼脂水解酶， 40°C 孵育直到琼脂糖完全融化。如 Y A C D N A 将存放24h 以上，应在55°C 灭活琼脂水解酶10min，存放于4°C 。 4•可通过脉冲场电泳或Southern斑点杂交检测纯化的Y A C D N A 的完整性。 • 5 . 为了优化条件，接种2X 105〜4X 105 靶细胞至35m m 组织培养皿中， 18〜24h 后转 染。有些细胞须调整接种密度，使之18〜24h 后达到8 0 % 〜9 0 % 汇合。 6. 准备6 个 5m l 聚苯乙婦管，先加人2004无血清培养基，再分别加人0、 5、 10、 20、 40、 80吨阳离子脂质体和IOOng阳性对照质粒。室温孵育45min，使之形成稳定的 脂质/D N A 复合体。然后加入0.8m l 无血清、无抗生素的培养基。 7. 吸除靶细胞的培养基，分别加入Iml脂质/D N A 混合物，培养4〜18h (依细胞类型 而异） 。 8 . 用含血清和抗生素的培养基换液，培养24〜48h。用胰酶消化各皿中细胞，分别传 至 I O O m m 组织培养皿，用 含 200〜800|ug/ml G 418的筛选培养基培养。在 8〜I4d 后，计数各皿G 418抗性克隆数，确定克隆形成数最多的脂转条件。 9. 确定转染条件后，用含血清和抗生素的培养基接种最终转染靶细胞，使之培养24〜 48h 后达到8 0 % 汇合。 10. 按第8 步中确定的量将适量脂质体和约IOOng 纯化的Y A C D N A 混 合 （ 由第3 步所 得） 。室温孵育“ min使之形成脂质/D N A 复合体。 胶 纯 化 Y A C D N A 的 浓 度 由 乙 啡 啶 琼 脂 板 滴 定 测 得 （ 支 持 方 案 3)。如 果 纯 化 的 Y A C D N A 农 度 未 知 ，使 用 体 积 梯 度 （ 如 IOOjuI' 2 ( % 1 、 4 ( % 1 、 IOOOjlJ) 11. 加 入 Im l无血清培养基，用无血清培养基漂洗细胞一次，然后加入脂质/DNA混 合 物。培 养 4〜18h (依细胞类型而异） 。 12. 用含血清的完全培养基换液，培养24〜48h 至脂转结束。胰酶消化，将细胞传代 (通常1 : 2 或 1 :4 传代） 传 代 比 例 由 生 长 率 和 G 418敏 感 细 胞 死 亡 时 间 决 定 。 传 代 后 的 细 胞 密 度 应 保 证 G 4 1 8 敏 感 细 胞 死 亡 前 没 有 过 度 生 长 。 13. 用含血清和200〜80(^g/mlG 418的完全培养基培养。筛选、培养、扩增、鉴定转 化 细 胞 （ 基本方案1)。
支持方案1 通过同源重组将哺乳动物筛选标记引入YACS 材 料 （ 标V 的条目参见附录1) pDC47 ( A T C C # 8 7 0 2 8 ; 图 5. 3. 2 ) 或其他带有H I S 3 突 变筛选标记的integrating 质粒 用于线性化integrating质粒的限制性内切核酸酶和缓冲液（ 图 5. 3. 2) V T E 缓 冲液， p H 7. 5 带有Y A C 的 H J S S 突 变 酵母株 • VS D 缺陷皿和培养基： SEMJra-Trp 和 SD-Ura-Trp-His V Y P D 培养基 V 乙酸锂/Tris/EDTA溶液 •740% P E G 溶液 放射性标记的iVe〇 、 U R A 3 、 T R R Z 和重复元件的探针（ 表 5. 3. 2 放射性标记法； 附 录 3E) n/0. Sjug/m l 溴化乙键 Q a 工、 I 和其他适用于分析转化产物的限制性内切核酸酶（ 图 5. 3. 2) 30°C 温箱和摇床 B e c kman离心机和T H 4 转子 42°C 水浴 硝基纤维膜和尼龙膜 X 光片 1. 用合适的限制性内切核酸酶线性化20砘？〇〇47 (如 利 用 ^^1位 点 将 ？0(：47连人 Y A C 载体臂或利用S m a 工位点连人A h 序列区） ；用乙醇沉淀D N A ，溶解在20； xl T E 缓冲液中，可将酶切产物浓缩。 2. 将 H Z S S 突变的酵母株接种在SEMJra-Trp皿上， 30°C 培养3d，直至长出克隆。 3. 挑单个酵母克隆至装有5ml Y P D 培养基的15m l 组织培养實中， 30°C 培养过夜至饱 和生长。将 〇.5m l 饱和培养物接种至150m l 培养瓶中，加人50ml SEMJra-Trp培养 基，培养至O D 600达到1〜2 (6〜10h ，依酵母株而异） 4 . 室温5OOg (使 用 BeckmanTH4 转子时，转速为2000r/min) 将培养物离心5min， 弃上清，加人IOml新配制的“乙酸锂/Tris/E D T A 溶液”，剧烈振荡重悬沉淀。重 复沉淀、重悬1 次。 5. 30°C 静置培养30min， 4°C 静置过夜。 6 . 室温500g 离心培养物。加入Iml “乙酸锂/Tris/E D T A 溶液”，剧烈振荡重悬沉淀。 分装成IOOjul每管，用于转化。 7•取3〜10吨线性化的pDC47 D N A (溶于< l〇 W T E 中，见第1 步）至 IOOjuI酵母感 受态细胞中。剧烈振荡2s， 30°C 孵育lOmin。 8 . 每管加人0.5ml P E G 溶液，中等速度轻轻振荡。 30°C 孵育60min。 9. 42°C热激酵母细胞5min

0. 室温下，加灭菌水至充满整管，振荡，高速点离5s。弃上清液，加 入 Iml灭菌水， 中速振荡重悬酵母细胞。室温，高速点离5s。 1 1 . 用 5〇 4 灭菌水重悬细胞，涂在SI>Um-Trp-His琼脂皿上， 30°C培养3〜 4d。 12•将每个的酵母集落划线接种在1/8个 S I > U m _ T rp-HiS 琼脂皿上。 30°C培 养 2〜3d 至克隆形成。 13. 挑 His+ Trp+ Ura+ 单克隆，在 SEMJra-Trp-His培养基中扩增。 14. 从单克隆酵母扩增物中抽提高分子质量D N A 制备琼脂糖块（ 单元5.1) 。 以可以分 离 Y A C 分子大小的条件电泳分离染色体，同时电泳未转Y A C 的相应酵母细胞 D N A 和带有Y A C 的酵母细胞D N A 作为对照。 1 5 . 用溴化乙锭染胶，拍照，并印迹转移到硝基纤维膜或尼龙膜上。 16. 以放射标记的狀〇 探针检测印迹膜。洗脱狀〇探针，依次使用放射性标记的O R A 、 T R P 和重复元件探针检测。每次杂交前，均应将印迹膜用X 光片曝光12〜24h ， 以保证前一探针已完全洗脱。 17. 用包括Ec0R I 、 Q a I 在内的限制性内切核酸酶酶切单克隆转化物，酶切产物跑琼 脂糖胶分离， Southern印迹杂交。依次使用n⑵、 T R P j 和种属特异性重复D N A 元件探针杂交、放射性自显影，洗脱后再次杂交。 18. 实验确定重复元件谱（ repetitive-elememt“profile”）（ 基本方案1，第 21步） 。包括 脉冲场电泳（ P F G E ) 实 验 （ 第 14步）中相同的对照。 19. 验证neo、 T R W 探针检测到的条带大小是否与预期大小相符（ 图 5. 3. 2)，验证所 得克隆的重复D N A 元件谱与原Y A C 或重组Y A C 的重复D N A 元件谱是否一致。 支持方案2 通过脉冲场电泳纯化YAC 材 料 （ 标V 的条目参见附录1) 带有Y A C 的酵母株 V 0.5X T B E 缓冲液 低 溶 点 胶 （low gelling/melting temperature agarose) (如 SeaPlaque G T G grade、 F M C Bioproduct) 琼脂糖胶中的高分子质量标准指示物（ 单元5.1) 含 0. l m g / m l溴化乙锭的0. 5 X T B E 缓冲液 V 透析缓冲液n 10mg/ml 多 聚 L-赖 氨 酸 （ poly-L-lysine) (Sigma;可 选 ） 琼脂水解酶（New England Biolabs) 或琼脂酶（Epicenter Techologies) 透析膜 专用凝胶灌制板（customized gel casting plate) (可选；图 5. 3. 3) 预冷到 4°C 的脉冲场凝胶电泳（ pulsed-field gel electrophoresis, P F G E ) 仪 带采图设备的短波中波紫外透照器 标 尺 （ 最好可激发荧光） 60°C和 42°C热 块 （heating block)
1. 制备Y A C D N A 琼脂糖块，并在0,5X T B E 缓冲液中透析（ 单 元 5.1，支持方案2; 用 0.5 X T B E 代替T E 透析)。 2 . 在 4°C 冷房，用 0.5 X T B E 缓冲液制备0.5〜0.8的低熔点琼脂糖胶。用有一个大格 的梳齿或将小格用胶带包裹，使凝胶中间有一个长点样槽，两边各有两个用于点分 子质量标准的小槽。 低 熔 点 胶 需 I h 才 可 凝 固 ，凝 固 的 胶 柔 软 易 碎 且 与 灌 制 板 黏 附 不 佳 。 一 个 方 法 是 使 用 边 缘 有 尼 龙 搭 链 （ Velcro)的 玻 璃 灌 胶 板 （ 图 5.3.3) ，凝 肢 与 尼 龙 嵌 合 ， 当移 动 胶 板 时 ，胶 板 可 起 到 固 定 支 持 凝 胶 的 作 用 。 另 一 方 法 是 使 用 毛 玻 璃 作 灌 肢 板 。 3 . 通过三种电压的变化（ 总共1000V ) 用 0.5X T B E 平衡琼脂糖胶30min。通过纵长将 Y A C D N A block加入胶中，尽量使其靠紧，但不要使其出现明显的压缩。再用少许融 化的琼脂糖胶（ 与制胶的胶相同）封住胶孔。在外部的孔中点入分子质量标准物。 4 . 将玻璃板置于P F G E 装置上，其中含有预冷的0.5X T B E ，让胶平衡10〜15min。在 合适的参数下跑胶（ 改变时间、电压和跑胶时间） ，尽可能使感兴趣的D N A 片段大 小能够最大限度的跑开。 5 . 电泳完成后，切去胶的左右两边，包括分子质量标准物和小部分的样品D N A 。小心 地将胶移入成有〇.5X T B E 配成的0 •lmg/m 卜溴乙淀的玻璃或塑料皿中，染色30〜 6〇1^11。再换用0.5\丁3£缓冲液去染色30〜6〇1^11。 6 . 将胶置于U V 扫 胶 仪 （ transilluminator) 上，照相。在未染色的胶的任意一边放两 把尺。在胶的横向上放置第三把尺用作尺寸的对照。用一把干净的手术刀将含有 Y A C 条带的胶切出，呈条状，保证大小为l c m X 1 6 c m 。 7 . 将切下的胶放入5O m l 离心管中， 4°C下，用至少三种体积变化的透析缓冲液II (30〜40ml) 透析12h 以上。尽快使用D N A (在几天至一个星期内） 。 如果D N A 要 用来做转染，加入 IO jlJ 10m g / m l 多聚L-赖氨酸。 8 . 将胶分装成〇.5〜2. O m l —份 ，转入小的离心管内。 65°C 溶 胶 lOmin， 4〇° C 下平衡 5min。加 人 I O U 的琼脂水解酶，轻轻混勻， 40°C 下水解60〜120min。为长期保存， 55°C 下热变性琼脂糖水解酶lOmin
支持方案3 通过溴化乙锭/琼脂糖胶快速预测D N A 浓度 材 料 （ 标V 的条目参见附录1) 0.8% (m /V ) 琼脂糖含1120 V 10m g /m 卜溴化乙徒 ljug/ V I D N A 储 存 液 （ 冻存；若没有污染，可以反复解冻） 未知D N A 样品 60m m 直径的佩特里细菌培养皿（petri plates) 1.制备10〇1111〇.8%琼脂糖。冷却至50。 (：，加入1(^11〇11^/1111溴化乙锭。搅拌混勻， 倒入8 个 60m m 直径的佩特里细菌培养皿中。室温下2〜3h 使其变硬变干。用 ParaHim包裹， 4°C 下保存少于1 个月。 2•用ljug/M 储存液配制7 个 I : 1 系列的稀释液，提供8 个标准溶剂，浓度从IjugzVl 至 7. 8ng/ 4 不等。取 0.5/J 每一种标准溶液和0. 5^1未知D N A ，以分散的点加入到 溴化乙淀/琼脂糖平板上。保持15min。 3•在U V 扫胶仪上照相。通过未知浓度和标准稀释度的不同荧光强度的比较，预测浓度。

来源：丁香实验

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