基本方案1 采用高密度和低密度阵列制备克隆和 DNA

由于原代的转化子只能产生数目有限的滤膜，因而随机铺板不适合滤膜的制备以及 YAC、BAC 和 PAC 文库的保存，而且由于克隆增殖率存在差别，因而无论是哪一种扩增形式都会将偏差带人文库中去。因此，原代的转化子应加入微孔板中，放置于-8℃ 保存。这使得制造分配用的文库拷贝变得简单易行，而且使组与组之间直接用阳性板子的地址进行数据扫描的交流更易进行。此外，微孔板的样式要适合手工和自动化地进行低密度和高密度的杂交膜的制备，包括采用一些带有多个金属和塑料尖头的设备来进行杂交膜的制备。这个基本方案介绍了制备膜的方法。

重复铺 YAC 转化板

这一步骤主要用于将连接到 YAC 载体中的大分子质量的基因组 DNA 转化到 S. 细胞中，这一过程需利用酶去除酵母的细胞壁。转化子较脆弱，必须在一个琼脂的支持层上生长。这样就不需要将 YAC 克隆挑至杂交膜上去了。解决这一问题的一个方法就是采用一个金属的挑克隆的设备（或金属的丝绒），这样可采用成千上万的针头将原代转化的琼脂板中突起的细胞转移到选择性琼脂板的表面。一个拥有 40000 个针头的金属克隆复制机可从 ICRT 购得。琼脂层应尽可能的薄，这样就会随着在其上的克隆的生长而变干，从而使复制机能更容易地接触琼脂上的克隆。复制机要用 99% 或 95% 的工业级别的乙醇浸泡消毒，然后通过燃烧去除乙醇。也可高压蒸汽灭菌 fabricvelvets，但克隆在转移时会戮出得更多。

当克隆长出以后，可将一张干的尼龙膜放置到克隆上 15 min，就可将克隆转移到膜上。然后克隆在原位被裂解而释放出 DNA 以进行杂交。可从初始转化平板印模一次得到几个平板的拷贝。过滤器推力可以由每块补救板材产生，并且正面克隆可以与其中一个琼脂拷贝分开。琼脂拷贝能在 4°C 储存数周。如要冻存，可将有克隆的一面朝下放到一张冰冻的 Whatman3 MM 的滤纸上，这张滤纸须用含 30% 甘油的 YPD 培养基浸泡过。将这张滤纸夹到聚碳酸板中，然后冻存于一 7 〇°C 中。阳性克隆可从膜中剪出，然后将它们单独放到琼脂上以产生新的克隆。

不巧的是，滤膜的数目和每一张滤膜上克隆的数目有限，并且琼脂板和冻存的滤膜都不能给克隆提供理想的冻存条件。因此这些滤膜不适合大规模的基因组绘图实验，这些实验要求对同一克隆进行多次杂交，并需要简单易行的良好的保存克隆的方法。

如果要得到大量滤膜进行杂交以筛选 YAC 文库，就有必要将初始的转化平板上的 YAC 克隆挑出，然后将其接种到微孔板中。这些克隆可在含 20% 甘油的条件下保存于一 7 〇°C。复苏这些克隆时可用非筛选性培养基（如 YPD 培养基）。

手工或利用机器制备低密度到中密度的克隆和滤膜

可采用手工的方法利用带有 96 个（384 个）实心（空心）针头金属（塑料）的设备制备低密度的 YAC、BAC、PAC 滤膜（图 5.2.1)。这些设备也可用于 YACDNA 样品（从 YAC 克隆获得的酵母总 DNA，从 YAC 中获得的 Alu-PCR 产物、YAC 池）的排列，gidding 工具可从许多商业公司得到（如 V&-PScientific、Sigma、Nunc、Dynatech、Genetix、Techne)。

根据阵列的样品的不同（DNA 或克隆），放置在阵列设备上的装置也有所不同。这是因为，哪怕很少的细胞都能形成克隆，尽管转移的细胞数是变化的，但并不会对最后的膜产生严重的影响，而如果加到每一个点中的 DNA 溶液的体积出现差异的话，就会直接影响到杂交信号的强弱。

在选择阵列 DNA 溶液的设备时，主要考虑的方面是所运送的体积、显示结果的点所占的区域大小、针头之间所转移溶液体积的变异性。空心针和塑料针能比金属实现针运送更多的体积。这有利于将 YAC 克隆接种到微孔板中以及运送 YAC 克隆的总 YACDNA 的稀释溶液。然而具有较小运送体积的实心金属针头在运送相对浓度较高的 IRS-PCR 产物时显得更有效，因为其能够通过中等的体积得到较强的信号 (从而能制备出更多的膜），而且其能适合提高点（spot) 的密度。金属针的针头之间的变异性较低。如果需要更多的 DNA 以提供足够的信号，最好采用只能运送很少体积的针点样 3 次、4 次、5 次或更多次，这样所点的区域和所使用样品的体积可控制到最小限度。这些操作可利用带有用于阵列装置模板的自动化仪器完成（见下面）。

在使用一个 96 针或 384 针的复制机之前，要将其针浸泡于 95% 的乙醇中灭菌。乙醇的深度要高于微孔板的深度。随后小心地将复制机在火焰上短暂地过一下，以便去处多余的乙醇。一些塑料的复制机可进行高压蒸汽灭菌。

多针头的复制机用于将微孔板中的细胞或 DNA 拷贝到尼龙膜上。没有电荷的尼龙膜（如 HybondN、Amersham) 或带正电荷的膜（如 HybondN+、Amersham) 能用于 YAC 克隆，但带正电荷的膜应用于 BAC 和 PAC 以及 DNA。X 抒 YAC 的网格划分，有必要用复制机的针拨孔底的细胞层，对于克隆的网格划分，在划网格之前，可将尼龙膜放到一合适的营养琼脂板上。

对所有的触头与过滤器外表接触时应该谨慎操作。栅格化后，琼脂板和过滤器应在 30°C 孵化 27 h(YAC) 或在倒置环境下 37°C 孵化 12?16 h(BAC、PAC)。用适当的方法将菌落溶解。在这种方法中低密度的栅格用来对较小的基因组的杂交进行分析，备用，或者 PCR 筛选的单微量滴定法皿来跟踪一个克隆，将克隆进行杂交，用以此克隆的杂交。

高密度菌落和 DNA 过滤器的自动栅格化

高密度克隆和 DNA 芯片可以通过客户建立和商业化自动化系统定制。商业自动化系统可从 Genetix、BioRobotics、GenomicSolutions、Beckman 公司获得。这些系统有额外的功能，如克隆的精选、标准模式及其他模式的选取。这些栅格化的系统的特性在表 5.2.1 中列出。表 5.2.2 显示自动栅格化系统的实例，其由一个精度为 5 Mm，建立在线性诱导驱动上的平台。这些机器设计时达到可使用在一 80°C 贮藏架保存的微量滴定板材料的水平，也可以在 12 个栅格的琼脂皿（8 cmX12 cm) 的容器中进行过滤。

这些操作涉及自动化菌落栅格化及它们的变更，其如下。在每次栅格化运行前的准备，用 95% 的乙醇进行灭菌操作。Ink 和声处理为可选择性但推荐使用的方法。Ink[如 autoclaved1%(V/V)HigginsBlackMagicink] 用于产生一个与最终克隆结果精确配对的栅格。

作为一个辅助来评价杂交数据。声处理室包含 0.1%(V/V) 的 DeconNeutmcon(Merck)，用于 ink 栅格化和每次栅格化运行结束后针的清洗。如果声处理室无效，栅格针应用 Decon 液进行刷洗。栅格化的材料的板在室温下的单层中溶解，然后放置到仪器床上。一些系统（图 5.2.2) 允许自动化选板和去盖，而其他仪器盖子只是在开始运行机器前手动去掉。这种接受尼龙过滤板 (见下面膜类型) 也位于机器床上，同时营养物琼脂板或者 Whatman3 MM 型过滤纸被营养液弄湿。这种仪器被适当的栅格工具装备，相比于固定的针能完美地浮动（图 5.2.3)。这样就能保证过滤器和针能在所有位置上较好的接触，同时使过滤器的损伤最小化，同时保证针与微量滴定板孔的底部的接触。后者对 YAC 库尤其重要，由于酵母细胞在中密度液体中沉降很快。当栅格化一个 YAC 板较多拷贝时，仪器会按程序设计进行，于是栅格化针绕容器成螺旋状旋转。这种板在栅格前在商业化的摇床上摇动。最后这 ff1 栅格区域关闭，原因在于使用安全和使污染最小化。一些如空气过滤的设计装置用于最小化污染。仪器内部在栅格化操作前会被紫外线照射。

仪器初始化，选择程序来执行下列步骤：

1. 把针头浸入灭菌池；

2. 蒸发乙醇；

3. 把针头浸人第一个微量滴定板；

4. 栅格化薄膜 1;

5. 对于所有接下来的过滤重复第 3 和 4 步；

6. 对于所有接下来的微量滴定板重复第 1~5 步。

   一些机器需要装备干燥器 (强力热风或齒素灯) 用于乙醇蒸发，但也有用风干的方法。

   在这两种情况下，精确的杀菌和干燥的时间应该根据经验来制定。一个微量滴定板的加样位置与下一个位点轻微的偏移, 允许大量的克隆分配在相对小的区域里。

   克隆的适当密度依赖于需要被网格化的克隆总量，滤纸上的每个克隆的拷贝数量，针头的直径和自动图像分析系统评分的可行性。实际上，油墨栅格的存在允许对于 4X4 密度为 384 孔格的精确手工评分（也就是说，16384 孔板在 8 cmX12 cm 的滤纸上或 6X16384 孔板在 22 cmX22 Cm 的滤纸上）。高密度栅格的应用需要使用针对阳性信号或针对每个克隆多样点样方案评分的自动化体系 (如下）。

   经鉴定阳性克隆或 DNA 池的微量滴定板地址与它们在网格上的坐标相符（图 5.2.4)。在非常高的密度下，坐标分配可能有问题，但是可以辅助于各种方法，包括油墨栅格的运用。另外一种受到一些研究者喜爱的方法是运用一种特意设计的根据这个方格内的两个杂交信号的相对位置来显示阳性板数目的栅格顺序将每个板栅格化两次。这种方法明显的缺陷是在一个过滤器上出现的克隆数目会减半。