相关实验：巨噬细胞抗肿瘤活性的检测
最新修订时间：2022-02-10
材料与仪器
步骤
来源：丁香实验
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![具有肿瘤细胞杀伤活性的小鼠巨噬细胞株，如 A N A -1 和 G G 2E E (可与撰稿人联 系）。小鼠原代巨噬细胞可新鲜分离。 注 ：进行巨嗟细胞实验时，避免使用玻璃或聚苯乙烯材料的器材。 材 料 （带V 项 目 见 附 录 1) 小鼠巨噬细胞：细胞株或新鲜分离细胞（单 元 6.1) 7 无 Ca2+ 、 M g 2+ 的 H B S S 缓冲液，预热 至 25°C 和 37DC V D M E M -I O 或 R P M I -I O 完全培养基，不 含 2-M E ，且 F B S 不 含 内 毒 素 （如 HyClone 公 司 的 0—狀(1?33; 56{€加热3〇 111丨11灭活），预热至25°(：和 37( € 待测试剂：检测是否能诱导巨噬细胞产生抗肿瘤活性 [111In] 标记的肿瘤靶细胞悬液， 2. 5 X 104个细胞/ml (见辅助方案） 10 % (m /V ) S D S 或 0.5mol/L HCl (用于贴壁性肿瘤细胞) 50m l 锥底聚丙烯塑料离心管 9 6 孔 圆 底 培 养 板 （Dynatech) 和 培 养 板 盖 （Flow Laboratories) Cornwall 连 续 吸 样 器 （Becton Dickinson Labware)](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/B1469605622468msppbsm8zupng_small.jpg)
![Giemsa染 色 （附 录 3D ) 以确定腹腔细胞中巨噬细胞百分比。 . 调整巨噬细胞浓度至4 X 106个细胞/m l 。 巨噬细胞最适农度应根据巨噬细胞和肿瘤靶细胞的最佳效靶比（E /T ) 确 定 ， 而最佳效靶比可通过不同效靶比下的剂量反应曲线选定。如 P 81 5 肿瘤细胞，本方案 的最适E /T 比为40:1 (即每孔2 0 0 4 培养基中含巨噬细胞2 X 105个，肿瘤细胞5 X IO3个）。 . 用 25°C 预热的完全培养基稀释待测试剂，浓度为终浓度的4 倍 。 对于巨噬细胞株 a. 在 9 6 孔圆底培养板加入50M1待检试剂，设 3 复孔。预 留 出 中 间 6 个 孔 （对照孔） 和培养板四周所有孔（只加培养基，以减少待测孔的液体挥发）。 a. 在待检孔中加入10〇 W 25°C预热的完全培养基。 a. 再 加 入 50M1巨 噬 细 胞 悬 液 （每孔总体积200W )。 对于新鲜分离的巨噬细胞 b. 在 9 6 孔圆底培养板中加入50^1巨噬细胞悬液，设 3 复孔。预留出培养板四周所有 孔及中间 6 个孔不加细胞。培 养 2h 使巨噬细胞贴壁。 b•洗去非贴壁细胞，然后每孔中加入50； xl25°C 预热的完全培养基。 b. 在细胞孔中加入50M1待检试剂，设 3 复孔，再 加 入 100M1 25°C 预热的完全培养基 (每孔总体积20(^1)。 . 在预留的四周边缘孔和中间6 个对照孔中加入200|ul完全培养基。培 养 18〜24h 。 . 用 37°C 预 热 的 H B S S 洗涤细胞3 次 ，彻底吸弃孔中残存的洗液。 对于非贴壁型巨噬细胞，其洗涤程序应相应调整，与贴壁细胞的洗涤方法不同， 应先小心吸弃洗液，接 着 加 入 预 热 的 H B S S ，然后将细胞培养板离心后，再吸弃洗 液。重 复 3 次。 0 . 每孔加入200^1 [111In] 标 记 的 肿 瘤 细 胞 悬 液 （浓 度 2. 5 X 104个细胞/ml)，包 括 6 个对照孔。培 养 24h 。 1•将培养板25°C ， 300g 离 心 5min。 2 . 取 100M1细胞培养上清，包 括 6 个对照孔中的3 个 孔 （自然释放孔），分别加入预先 编号标记的7 计数管中。 3a. 肿瘤靶细胞为悬浮细胞时：将 剩 余 3 个 对 照 孔 中 （最大释放孔） 的细胞轻轻吹打 混勻。取1〇〇沁细胞悬液加入7 计数管中。 3b. 肿瘤靶细胞为贴壁细胞时：在 剩 余 3 个 对 照 孔 中 （最大释放孔）加 入 25M1 10% S D S 或 0.5mol/L H C l 0 吹打混匀后，取 100M1细胞裂解液加入7 计数管中。 4 . 按照说明书用7 计数仪检测实验孔和对照孔的Imin [111In] 放射值。 3 个空白孔的 平均放射值作为本底，将样品孔和对照孔的平均放射值减去本底。 5 . 计算巨噬细胞杀伤活性百分比： 杀伤活性百分比= (实 验 组 cp m — 自发释放组cpm) (最大释放组c p m — 自发释放组cpm)](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/B1469605686061k5mkmmq34ipng_small.jpg)
![本 方 案 以 P 8 1 5 细 胞 株 为 例 ，此 方 法 也 适 用 于 其 他 肿 瘤 细 胞 株 ，如 L 5178Y 、 210、 E L 4 、 E M T -6、 M C A 26、 L -929 和 W E H I -164 (均购自 A T C C )。 不同靶细胞的 养条件应根据预实验调整。巨噬细胞杀伤活性检测所用靶细胞应处于最佳生长状态。 料 （带V 项 目 见 附 录 1) 肿瘤靶细胞：如肥大细胞株P 815 (A T C C # T I B 64) V R P M I - I O 完全培养基，预 热 至 37°C lmCi/ml [111In] 羧 基 喹 啉 （A m e r s h a m Medi-Physics) 75cm2细胞培养瓶 50m l 锥底聚丙烯塑料离心管 Sorvall R T 6000离心机及 H 1000B 转 子 （或替代品） 为确保实验时P 815处于最佳生长状态，实验前每两天用新鲜R P M I -10将细胞传代， 浓 度 5 X 104个细胞/ml ( 如 75c m 2细 胞 培 养 瓶 中 加 入 40m l 培养 基 ，含 2 X 106个细 胞）。这种条件下，每两天将细胞1 : 4 0 传代培养。 同位素标记前一天，制备肿瘤细胞悬液，调整浓度为4 X 105个细胞/ml (如 75cm2细 胞培养瓶加入30m l 培养基，含 1.2X 107个细胞）。 标记当天，台盼蓝拒染法测定肿瘤细胞活力（附 录 3 0 。 取 I X l O 7个细胞加入50m l 锥底聚丙烯塑料离心管中。室温， 300g•离心5min，弃上 清 ，操作应轻。加 入 IOml 25°C 预 热 的 R P M I -10洗涤细胞，然 后 加 入 Iml 25°C 预热 的 R P M I - I O 重悬细胞。](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/B1469605706296yme3p97rt6png_small.jpg)
![5• 加 入 40； xCi [m In] 羟 基 喹 啉 。应 根 据 [111In] 衰 变 系 数 （表 6 . 7 . 2 ) 计算所需 [m In]的正确剂量。 [111In] 羟基喹啉放射活性强，但半衰期很短，正确计算实验当天放射活性尤为 重要。](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/A1469605718803w4wrxg6g5vpng_small.jpg)
