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巨 噬 细 胞 抗 肿 瘤 活 性 的 检 测

相关实验:巨噬细胞抗肿瘤活性的检测

最新修订时间:

材料与仪器

步骤

基本方案 [111In] 释放法检测巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤作用

材 料

具有肿瘤细胞杀伤活性的小鼠巨噬细胞株,如 A N A -1 和 G G 2E E (可与撰稿人联 系)。小鼠原代巨噬细胞可新鲜分离。 注 :进行巨嗟细胞实验时,避免使用玻璃或聚苯乙烯材料的器材。 材 料 (带V 项 目 见 附 录 1) 小鼠巨噬细胞:细胞株或新鲜分离细胞(单 元 6.1) 7 无 Ca2+ 、 M g 2+ 的 H B S S 缓冲液,预热 至 25°C 和 37DC V D M E M -I O 或 R P M I -I O 完全培养基,不 含 2-M E ,且 F B S 不 含 内 毒 素 (如 HyClone 公 司 的 0—狀(1?33; 56{€加热3〇 111丨11灭活),预热至25°(:和 37( € 待测试剂:检测是否能诱导巨噬细胞产生抗肿瘤活性 [111In] 标记的肿瘤靶细胞悬液, 2. 5 X 104个细胞/ml (见辅助方案) 10 % (m /V ) S D S 或 0.5mol/L HCl (用于贴壁性肿瘤细胞) 50m l 锥底聚丙烯塑料离心管 9 6 孔 圆 底 培 养 板 (Dynatech) 和 培 养 板 盖 (Flow Laboratories) Cornwall 连 续 吸 样 器 (Becton Dickinson Labware)
图 6. 7 . 1 巨噬细胞抗肿瘤活性检测的流程图。 Sorvall R T 6 0 0 0 离心机 及 HlOOOB转 子 (或替代品) 1 . 制备小鼠巨噬细胞悬液:将细胞加入50m l锥底聚丙烯塑料离心管, 弃上清,加 入 IOml 25°C预 热 的 H B S S缓冲液。再 洗 涤 细 胞 2 次 ,矣 预 热 的 DM EM -1 0 或 R P M M O 完全培养基重悬细胞。 2 . 台盼蓝拒染法检测细胞活力(附 录 3 0 。对于新鲜分离的巨噬细胞, 肿瘤靶细胞的培养 (辅助方案步骤1) 靶细胞的裂解 (辅助方案步骤2) 同位素标记靶细胞 (辅助方案步骤3〜8) 第 天 洗涤巨噬细胞去除待测试剂 (基本方案步骤9) Oc l m l 第二天 第三天 g 心 用 Oo 后 3 长 还需用 W righ
Giemsa染 色 (附 录 3D ) 以确定腹腔细胞中巨噬细胞百分比。 . 调整巨噬细胞浓度至4 X 106个细胞/m l 。 巨噬细胞最适农度应根据巨噬细胞和肿瘤靶细胞的最佳效靶比(E /T ) 确 定 , 而最佳效靶比可通过不同效靶比下的剂量反应曲线选定。如 P 81 5 肿瘤细胞,本方案 的最适E /T 比为40:1 (即每孔2 0 0 4 培养基中含巨噬细胞2 X 105个,肿瘤细胞5 X IO3个)。 . 用 25°C 预热的完全培养基稀释待测试剂,浓度为终浓度的4 倍 。 对于巨噬细胞株 a. 在 9 6 孔圆底培养板加入50M1待检试剂,设 3 复孔。预 留 出 中 间 6 个 孔 (对照孔) 和培养板四周所有孔(只加培养基,以减少待测孔的液体挥发)。 a. 在待检孔中加入10〇 W 25°C预热的完全培养基。 a. 再 加 入 50M1巨 噬 细 胞 悬 液 (每孔总体积200W )。 对于新鲜分离的巨噬细胞 b. 在 9 6 孔圆底培养板中加入50^1巨噬细胞悬液,设 3 复孔。预留出培养板四周所有 孔及中间 6 个孔不加细胞。培 养 2h 使巨噬细胞贴壁。 b•洗去非贴壁细胞,然后每孔中加入50; xl25°C 预热的完全培养基。 b. 在细胞孔中加入50M1待检试剂,设 3 复孔,再 加 入 100M1 25°C 预热的完全培养基 (每孔总体积20(^1)。 . 在预留的四周边缘孔和中间6 个对照孔中加入200|ul完全培养基。培 养 18〜24h 。 . 用 37°C 预 热 的 H B S S 洗涤细胞3 次 ,彻底吸弃孔中残存的洗液。 对于非贴壁型巨噬细胞,其洗涤程序应相应调整,与贴壁细胞的洗涤方法不同, 应先小心吸弃洗液,接 着 加 入 预 热 的 H B S S ,然后将细胞培养板离心后,再吸弃洗 液。重 复 3 次。 0 . 每孔加入200^1 [111In] 标 记 的 肿 瘤 细 胞 悬 液 (浓 度 2. 5 X 104个细胞/ml),包 括 6 个对照孔。培 养 24h 。 1•将培养板25°C , 300g 离 心 5min。 2 . 取 100M1细胞培养上清,包 括 6 个对照孔中的3 个 孔 (自然释放孔),分别加入预先 编号标记的7 计数管中。 3a. 肿瘤靶细胞为悬浮细胞时:将 剩 余 3 个 对 照 孔 中 (最大释放孔) 的细胞轻轻吹打 混勻。取1〇〇沁细胞悬液加入7 计数管中。 3b. 肿瘤靶细胞为贴壁细胞时:在 剩 余 3 个 对 照 孔 中 (最大释放孔)加 入 25M1 10% S D S 或 0.5mol/L H C l 0 吹打混匀后,取 100M1细胞裂解液加入7 计数管中。 4 . 按照说明书用7 计数仪检测实验孔和对照孔的Imin [111In] 放射值。 3 个空白孔的 平均放射值作为本底,将样品孔和对照孔的平均放射值减去本底。 5 . 计算巨噬细胞杀伤活性百分比: 杀伤活性百分比= (实 验 组 cp m — 自发释放组cpm) (最大释放组c p m — 自发释放组cpm)

辅助方案 [111In ] 标记肿瘤靶细胞

材 料

本 方 案 以 P 8 1 5 细 胞 株 为 例 ,此 方 法 也 适 用 于 其 他 肿 瘤 细 胞 株 ,如 L 5178Y 、 210、 E L 4 、 E M T -6、 M C A 26、 L -929 和 W E H I -164 (均购自 A T C C )。 不同靶细胞的 养条件应根据预实验调整。巨噬细胞杀伤活性检测所用靶细胞应处于最佳生长状态。 料 (带V 项 目 见 附 录 1) 肿瘤靶细胞:如肥大细胞株P 815 (A T C C # T I B 64) V R P M I - I O 完全培养基,预 热 至 37°C lmCi/ml [111In] 羧 基 喹 啉 (A m e r s h a m Medi-Physics) 75cm2细胞培养瓶 50m l 锥底聚丙烯塑料离心管 Sorvall R T 6000离心机及 H 1000B 转 子 (或替代品) 为确保实验时P 815处于最佳生长状态,实验前每两天用新鲜R P M I -10将细胞传代, 浓 度 5 X 104个细胞/ml ( 如 75c m 2细 胞 培 养 瓶 中 加 入 40m l 培养 基 ,含 2 X 106个细 胞)。这种条件下,每两天将细胞1 : 4 0 传代培养。 同位素标记前一天,制备肿瘤细胞悬液,调整浓度为4 X 105个细胞/ml (如 75cm2细 胞培养瓶加入30m l 培养基,含 1.2X 107个细胞)。 标记当天,台盼蓝拒染法测定肿瘤细胞活力(附 录 3 0 。 取 I X l O 7个细胞加入50m l 锥底聚丙烯塑料离心管中。室温, 300g•离心5min,弃上 清 ,操作应轻。加 入 IOml 25°C 预 热 的 R P M I -10洗涤细胞,然 后 加 入 Iml 25°C 预热 的 R P M I - I O 重悬细胞。
5• 加 入 40; xCi [m In] 羟 基 喹 啉 。应 根 据 [111In] 衰 变 系 数 (表 6 . 7 . 2 ) 计算所需 [m In]的正确剂量。 [111In] 羟基喹啉放射活性强,但半衰期很短,正确计算实验当天放射活性尤为 重要。

来源:丁香实验

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