小鼠巨噬细胞的分离（小鼠巨噬细胞的表型检测）

细胞悬液，荧光素标记的单克隆抗体（F4/80、30-H12、MI/70、HK1.4），IgG，ACK 裂解液，EMA，FITC 标记的链亲和素和 TC 标记的链亲和素，PBS，EP 管，离心管，移液枪及枪头，流式细胞仪，离心机

一、基本方案直标法检测小鼠巨噬细胞的表型

1、准备 4 只 12 mm × 75 mm 试管，将试管编号为 1~4。每管中加入 2 × I0⁷ 个细胞/ml 细胞悬液 50 ul。1 号管加 F4/80-TC、30-H12、生物素；2 号管加 F4/80-PE、MAC-1-FITC、生物素；3 号管不加；4 号管加 EMA。

2、每管加入 3 mg/ml 阻断 IgG 4 ul， 4 ℃ 孵育 10 min。

3、在 1 号和 2 号管中加入适量的生物素偶联的单抗，然后将 1 号、2 号和 3 号试管冰浴 15 min。

4、在 4 号管中加入 5 ml EMA，混匀。将试管置白炽灯（如 40 W 白炽灯）18 cm 远处，室温 10 min。

5、每管加入 3 ml PBS，1 500 g 离心 3 min。迅速倒掉上清，试管直立后，手指轻弹管底，使细胞沉淀变松。在 1 号管中加入 FITC 标记的链亲和素；2 号管中则加入 TC 标记的链亲和素。然后将 4 只试管冰浴 10 min，其中 3 号管和 4 号管的细胞弹松即可，不需补加液体。

6、样品含红细胞时（如新鲜分离的骨髓细胞或脾细胞），每管需加入 3 ml ACK 裂解液；不含红细胞的样品，每管加入 3 ml PBS。

7、盖紧试管盖，颠倒试管 1~2 次，混匀细胞后，室温静置 3 min。

8、室温，1 500 g 离心 4 min，迅速倒掉上清，试管直立后，轻弹管底使细胞沉淀变松。

9、加入 3 ml PBS 洗涤细胞，方法参见步骤 7 和 8。

10、用流式细胞仪进行检测，用 FACScan 分析结果。

二、备选方案间标法检测小鼠巨噬细胞的表型

1、准备 3 只 12 mm × 75 mm 试管，分别标记为待测管、对照管 A、对照管 B。每管加入 50 ul 待测细胞悬液，再加入 4 ul IgG，冰上孵育 10 min。

2、在待测管和 B 管中加入适量的未标记的一抗，A 管加入等量的对照一抗，混匀后 4 度孵育 15 min。

3、样品含红细胞时，后续洗涤步骤见基本方案 6~8。

4、每管加入 4 ul 浓度为 3 mg/ml 的正常小鼠血清 IgG。冰浴 10 min，以阻断二抗上非特异结合位点。

5、每管加入适量荧光素标记的抗 F（ab）二抗。混匀，冰浴 15 min。

6、按基本方案步骤 9 洗涤细胞。

7、可选操作：细胞不经洗涤，直接在待测管和 A 管中加入适量的第二种荧光素标记的二抗。B 管中加入等量的荧光素标记的小鼠 IgG， 用以检测步骤 6 的阻断效果。