小 鼠 巨 噬 细 胞 的 分 离

基 本 方 案 直 标 法 检 测 小 鼠 巨 噬 细 胞 的 表 型

材料

Sorvall RT 6000B 离心机
I . 准 备 4 只 12m m X 75m m 试管，将试管编号为 1〜4。每 管 中 加 入 2 X IO⁷个细胞/ml细胞悬液 50ul。

2.每管加入 3 mg/ml 阻断 I g G 4ul， 4°C 孵育 lOmin。

3 . 按 表 6. 2. 2 所示 ，在 1 号 和 2 号管中加入适量的生物素偶联的单抗，然 后 将 1 号 、 2号 和 3 号试管冰浴 15 min。

4 . 在 4 号管中加人 5M1 E M A ，混匀。将 试 管 置 白 炽 灯（如 40W 白炽灯）18c m 远 处 ，室 温 lOmin。E M A 只 能 进 入 死 细 胞 。 利 用 死 细 胞 的 强 染 色 性 ， 在 F L l 和 F L 3 双 变 量 散 点 图上 可 与 活 细 胞 相 区 分 。

5 . 每管加入 3m lPBS， 1500 g 离 心 3 min。 迅速倒掉上清，试管直立后，手指轻弹管底，使细胞沉淀变松。在 1 号管中加入 F IT C 标记的链亲和素； 2 号管中则加入 T C 标记的链亲和素。然后将 4 只试管冰浴 lOmin， 其 中 3 号管和 4 号管的细胞弹松即可，不需补加液体。

6 . 样 品 含 红 细 胞 时（如新鲜分离的骨髓细胞或脾细胞），每管需加入 3 m l A C K 裂解液；不含红细胞的样品，每管加入 3m l P B S 。

7 . 盖紧试管盖，颠倒试管 1〜2 次 ，混匀细胞后，室温静置 3 min。

8 . 室温， 1500&离 心 4 min，迅速倒掉上清，试管直立后，轻弹管底使细胞沉淀变松。

9 . 加 入 3 ml PBS 洗涤细胞，方法参见步骤 7 和 8 。

10a 直接检测时：加入 20()/^?83，混匀细胞， 4 ℃ 避 光 待 检（可保存<4h)。

IOb 固定后检测时：每管加人 IOOpJ 2 % 甲醛，混匀，加盖， 4°C 避光，固定 Ih 后待检。甲 醛 会 改 变 细 胞 的 光 散 射 值 。

II. 用流式细胞仪进行检测，然 后 用 F A C S c a n 分 析 结 果（第四章）

备 选 方 案 间 标 法 检 测 小 鼠 巨 噬 细 胞 的 表 型

附 加 材 料

4 . 每管加入 4ul 浓 度 为 3m g /m l 的正常小鼠血清 IgG。冰 浴 lOmin，以阻断二抗上非特异结合位点。

5 . 每管加入适量荧光素标记的抗 F (ab)[片段二抗。混 匀 ，冰 浴 15 min。

6 . 按基本方案步骤 9 洗涤细胞。

7 . 可选操作：细胞不经洗涤，直接在待测管和 A 管中加入适量的第二种荧光素标记的二抗。 B 管中加入等量的荧光素标记的小鼠 IgG， 用以检测步骤 6 的阻断效果。

8 . 余 下 步 骤参见基本方案步骤 9〜11