小鼠巨噬细胞的分离（小鼠腹腔巨噬细胞的分离）

基 本 方 案 1 小鼠腹腔巨噬细胞的分离

材料

小鼠，洁 净 环 境 中 饲 养（最好置层流柜中饲养）

7 3 % (m /V ) 豚 蛋 白 胨 或 者 3 % (W V r) Brewer 硫 基 乙 酸 盐 肉 汤（Brewerthioglycollate medium，分离炎性腹腔巨嗤细胞用）

7 0 % 乙醇

收集用培养基：含 5 % (v/V ) FBS (Hyclone，无内毒素）的 D M E M (G I B C O /B R L )

Diff-Quik 染液 I、 II 和 III (Baxter)

25 G 针头

6m l 和 30m l 注射器

镊 子 和平头外科剪（浸 于 7 0 % 乙醇中）

19 G 针头

50m l 聚丙烯锥底塑料离心管，冰上预冷

离 心 机（Shandon/Lipshaw)

细 胞 甩 片 机（Shandon/Lipshaw)

Sorvall R T 6000 离 心 机 及 H l O O O B 转 子（或替代品）

la. 收集静息腹腔巨噬细胞时：断 头 或 C O 2 窒 息 处 死 小 鼠（附 录 2 G )

Ib. 收集炎性腹腔巨噬细胞时：用 6m l 注射器吸取 Iml 3 % 豚蛋白胨肉汤。换 用 25 G 针头将肉汤注入小鼠腹腔（附 录 2E )。 3d 后断头或 C O 2 窒 息 处 死 小 鼠（附 录 2 G )。 也可腹腔注射 Iml 3 % Brewer 硫基乙酸盐肉汤， 5〜7d 后收集细胞。

2.7 0 % 乙醇消毒小鼠腹部。无菌剪开腹部毛皮，用镊子夹住腹部毛皮，向两边撕开，暴露完整腹膜。

3 . 将 1 9 G 针头装在 3 0 m l 注射器上，吸 取 I O m l 收集用培养基。针尖斜面向上，在腹中线 处 刺 透 腹 膜（附 录 2E ) ，将培养基注入腹腔。为防止刺破肠壁，在针尖穿过腹膜时 ，可推动针筒使少量培养基流经针头，进入腹腔。

4 . 调整针尖斜面向下，轻轻挑起腹膜，慢 慢 吸 回 腹 腔 灌 洗 液（每只小鼠约 8 ml)。将腹腔灌洗液加入冰上预冷的 50m l 聚丙烯塑料离心管中。

5 . 取 20ul 腹腔灌洗液，计 数（附 录 3A )。

6 . 取 0. 2m l 腹腔灌洗液加入细胞甩片机中。按说明书， 600r/m i n 离 心 6 min，制备细胞甩片。风干后，进 行 Diff-Quik 染色，并计数。

7 . 将剩余的腹腔灌洗液， 4°C ， 400 g 离 心 lOmin，弃上清，轻弹管底，混勻细胞。加入收集培养基调整细胞至合适浓度。

一 只 小 鼠 可 获 得 2 X 1 0 ⁶〜 3 X 1 0 ⁶ 个 腹 腔 细 胞 ， 其 中 巨 噬 细 胞 占 5 0 % 〜 7 0 % 。 月示蛋 白 胨 或 硫 基 乙 酸 盐 肉 汤 腹 腔 注 射 后 小 鼠 ， 每 只 可 分 别 获 得 3 X IO⁶〜 4 X IO⁶ 个 及 约IO⁷ 个 巨 噬 细 胞 。 这 些 促 炎 剂 可 募 集 新 生 的 、 未 成 熟 巨 噬 细 胞 至 腹 腔 。

基 本 方 案 2 小鼠骨髓巨噬细胞的分离和培养

材 料

小鼠 ，洁 净环境中饲养（最好置层流柜中饲养）

PBS

淋 巴细胞分 离 液（L S M ; Organon Teknika Cappel)

含添加 物 的 E M E M 和 E M E M -10

小鼠特异性 C S F 或 IL-3 (G e n z y m e )

II 型中性蛋白酶， 1.0m g / m l (BoehringerMannheim)

镊 子 和 剪 刀（浸 于 7 0 % 乙醇中）

25m l 注射器

26 G 针头

50m l 聚丙烯锥底塑料离心管，冰上预冷

15m l 聚丙烯锥底塑料离心管

Sorvall R T 6 0 0 0 离心机和 H B 1 0 0 0B 转 子（或替代品）

25c m 2 和 75c m 2 细 胞 培 养 瓶（Corning)

无菌橡皮细胞刮子

1 . 处 死 小 鼠（附 录 2 G )。将小鼠后肢的皮毛剥至足部。连同褪下的皮毛剪去双足。剪下后腿，放入盛有无菌 P B S 的培养皿中。

2 . 镊子夹住腿骨一端后，用剪刀剔除肌肉。在关节处剪断腿骨