中期染色体的荧光原位杂交

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

含有人类中期染色体的载玻片或盖玻片
变性液乙醇 Cot-1 DNA 非同位素标记的 DNA 探针去离子甲醜胺基本杂交混合液甲酰胺 SSC 生物素检测溶液 DAPI 适当的抗褪色剂
玻片染色缸水浴箱相差显微镜盖玻片橡皮泥湿盒干燥的玻片盒指甲油

步骤

1. 在 72°C 水浴箱中，把中期染色体的载玻片和盖玻片浸泡在染缸70°C 变性液中变性 2min (由温度计监控温度）。变性液置于水浴箱中不能超过30min。 2. 7 0 % 的冰冻乙醇漂洗玻片2min终止变性。然后，室温下过8 0 % 、 9 5 % 、 100%的乙醇脱水各2min，空气干燥。 3 . 用相差显微镜检查变性后的染色体标本。染色体标本应该内部结构清晰，没有中空和透明染色体。 4 . 冰冻脱水20〜150n g 的非同位素标记的D N A 探针（20n g 染色体特异性重复序列探针， 50〜I O O n g c D N A 和全染色体涂染探针，或 100〜150单拷贝基因探针，包括 Y A C )。如果探针包含散在重复序列和单一序列（如在各种载体中的单拷贝基因克

$隆，有散在重复和单一序列的探针、全染色体涂染探针），在冰冻脱水之前先加 10炖人Cot-1 D N A 以封闭重复元件。当含有一个Y A C 的总酵母D N A 作为探针时，要确定人类插入D N A 在酵母 D N A 中的比例和调高D N A 探针的总量使得杂交时人类D N A 达到最佳浓度。 5•将探针的离心沉淀物溶于IOi ^l去离子的甲酰胺中， 72°C 加热 IOmin变性D N A 。如果探针不需要封闭，立即置于冰上。如果探针需要封闭，置于37。 ( ：中预退火30min 至几个小时（长探针和有大量重复序列的探针要用更长的时间）。 6 . 在变性的探针中加IOjal基本杂交混合液。混匀，点离，滴于已变性的染色体玻片上。盖上22m m 2盖玻片，轻轻挤压出所有的气泡，橡皮泥封片， 37° c 湿盒，孵育过夜（14〜18h)。用着丝粒和全染色体涂染探针时，要减少孵育时间，一般少于处。 7 . 在杂交的最后30m in 时，将盛有50〇1150%甲酰胺/2\33(：洗液和5011112\33(：的染缸在水浴中加热至39°C 。 8•从湿盒中拿出玻片。揭去橡皮泥，仔细地去除盖玻片，在 39°C 的 5 0 % 甲酰胺/2X SSC、 39°C 的 2X S S C 和室温下的I X S S C 中洗涤杂交玻片，每次 15min。对着丝粒和全染色体涂染探针来说，要提高温度至42°C 并降低盐浓度，用 0.4X 〜1X S S C 。 9 . 玻片也可在室温下4 X S S C 中平衡5min。洗涤间要将玻片上的水甩干。但在洗涤过程或检测的任何时间都不能让玻片干燥。 10. 加 50/xl生物素检测溶液、地高辛检测溶液或生物素/地高辛检测溶液并且覆盖 22m m 2的石蜡膜。在铝箔包裹的湿盒中37°C孵育45min (检测试剂和D A P I 是光敏感的）。 11. 室温下，在铝箔包裹盛有4X S S C 、 0. 1 % Triton X -100/4X S S C 和 4X S S C 的染缸中，依次洗涤玻片，每次lOmin。 12. 加5〇4 D A P I 或碘化丙锭染液复染染色体，覆盖22m m 2的石蜡膜，可以在室温下染 lOmin。快速地在I X S S C 的染缸中漂洗去除过多的染液。吸干玻片上的水，但不能干燥。 D A P I 可显示一种类似于G 带的区带（单元4. 4 ) 并且能同时观察到荧光素和罗丹明或德克萨斯红。破化丙键染色更均匀，能同时观察到荧光素，但是不能看到罗丹明或德克萨斯红。 13•加7jul适当的抗褪色剂---如 D A B C O 用于绿色焚光、苯二胺或Vectashield用于红色荧光（不久也可用于荧光素。）盖上盖玻片，挤出过多的抗褪色剂，指甲油封闭。一20°C 储存在干燥的玻片盒中。立即检测（首选）或在4°C 或一20°C 储存几个星期。 14. 用落射光荧光显微镜和与荧光染料匹配的滤片检测玻片。 15.用 Ekter-1000 (适合于打印）或 Ekatachrome-400 (适合于幻灯片）彩色胶片摄像 (D A P I 曝光：约 2s; 双滤频滤光器： 30〜90s; 三滤频滤光器： 3〜8s)。强信号时 (如卫星序列，一些独特序列探针），在 A S A 200可以应用黑白胶片。此外，还可以用 C C D 相机和激光共聚焦显微镜制作数字化影像。 16a. DAPI-显带染色体：当两条染色单体均有信号时，才能在> 1 0 的杂交染色体上准确定位。比较D A P I 条带染色体图像上杂交信号的位置（通过双滤频或三滤频滤$
$光器观察）在染色体条带上的准确定位。 l6b. PI (碘化丙锭）-染色染色体：通过摄像或投影35m m 载玻片或数字化影像来扩大杂交染色体。以 I S C N 染色体模式图（附录 2B ) 作为标准（ Lichter祝， 1990)，通过比较短臂末端占染色体全长的比例获得FLPter值。支持方案1 生物素化信号的放大当背景清晰而探针只产生微弱的荧光时，可以放大信号。附加材料（见基本方案） 4 X S S C /1% (m /V ) B S A (成分V ) 中加入 1〜3/xg/m l 生物素化抗卵白素抗体 (Vector实验室）生物素扩增溶液： 4X S S C /1% (m A 〇 B S A (成分V )中加入 2〜5^g/m l 荧光素- 卵白素 D C S (VectorLaboratories) 1•生物素化的探针杂交玻片，洗涤，第一轮的信号检测如以上描述所示（基本方案，第 1〜11步)。 2•如果玻片已密封，用针或手术刀去除封片物和指甲油，在盛有0.1% Triton X -100/ 4X S S C 用铝箔包裹的染缸中轻轻振荡清洗玻片15min，使盖玻片滑脱。如果盖玻片很松，仔细地揭去即可。重复洗2 次。 3•擦干过量的洗涤溶液，加人 50/J 1〜3Mg/m l 生物素化抗卵白素抗体。盖上 22m m 2的石蜡膜，置于湿盒中，用铝箔包裹湿盒， 37°C 孵育 30m m 。 4 . 去掉石蜡膜，在 0. 1 % Triton X -100/4X S S C 中轻轻振荡清洗玻片15min。 5•擦干玻片上过多的水，加入 50W 生物素扩增溶液。盖上石蜡膜，在铝箔包裹的湿盒中， 37°C 孵育 30min。 6.去掉石蜡膜，在0.1%丁土〇11乂-100/4\33(：中轻轻振荡清洗玻片15111丨11，然后在 4 X S S C 中清洗15min。如果要增强信号，可以重复清洗3〜6 次（背景也会明显的增强）。 7•如以上描述所示复染、固定、检测玻片（基本方案，第 12〜16步）。支持方案2 地高辛标记探针信号的放大附加材料（见基本方案） 4X S S C / 1 % (m /V ) B S A (成分V ) 中加入 10jug/ml 绵羊抗地高辛（Boehringer Mannheim) F a b 片段（抗原结合片段）地高辛扩增溶液： 4 X S S C / 1 % (m /V ) B S A (成分V ) 中加入3. 5〜7.0pg/ml荧光素结合的兔抗绵羊IgG (Slgma) 1•地高辛标记探针杂交玻片，洗涤（基本方案，第 1〜8 步)。 2•载玻片上滴加5(V l l ( V g /m l 绵羊抗地高辛F a b 片段，盖上2 2 m m 2的石蜡膜。 37°C孵育 30mino 3•去掉石蜡膜，依次在 4 X S S C 、 0 . 1 % TritonX-100/4X S S C 、 4 X S S C 中洗涤玻片$

每次15min。 4 . 擦干过多的4X S S C ，在玻片上滴加5〇4地高辛扩增溶液。盖上 22m m 2的石蜡膜，在铝箔包裹的湿盒中， 37T：孵育30min。 5 . 再次洗漆，同第3 步。 6 . 如以上描述所示复染、固定、检测玻片（基本方案，第 12〜16步）。备选方案1 用辣根过氧化物酶进行酶检测在原位杂交中用酶检测系统产生稳定的有颜色的沉淀，这样就提供了一个持久的信号。直接酶偶联探针首选直接法（图 4. 4. 2) ，因为酶的偶联干扰了探针的渗透。表 4. 4. 1 总结了用于ISH (in situ hybridization,原位杂交）最常见的酶-底物复合体。这个方法描述了用H R P (horseradish peroxidase,辣根过氧化物酶）检测生物素化探针。 H R P 结合抗体同样可以使地高辛标记的探针显影。表 4 . 4 . 1 检测原位杂交探针常用的酶-底物复合物酶底物3 颜色b 碱性磷酸酶 5-溴-4-氣-3-口引噪-憐酸（5-brom o-4-chloro-3-in d o ly ip h o sp h ate B C IP) 和硝基四挫蓝（ n itro -b lu e te tra z o liu m ， N B T ) 紫蓝色沉淀 N aphtol-A S~M X -p h o sp h ate 和 fast red T R 红色沉淀和红色荧光 N aphtol-A S-M X -p h o sp h ate 和 fa st blue B N (B oeh rin g er) 蓝色沉淀 N ap h to l-A S~M X _phosphate 和 fast g reen B N (B oeh rin g er) 绿色沉淀 V ecto r 红红色沉淀 V ecto r 黑黑色沉淀 V ecto r 蓝蓝色沉淀辣根过氧化物酶 3， 3-diam inobenzidine te trah y d ro ch lo rid e (D A B ) 褐色沉淀C a . 这些试剂的主要供应厂商是 B o e h r i n g e r M a n n h e i m 、 L i f e T e c h n o l o g i e s 、 P r o m e g a 、 S i g m a 、 V e c t o r L a b o r a t o - r ie s ，但是别的商家提供相似的试剂。 b •这栏列出了杂交信号的最终结果，一般是用传统的明视场显微镜分析结果。 fast r e d 产生的荧光信号要用荧光显微镜分析。荧光检测的最佳方法已经被报道（ S p e e l M d ., 1992)。 a 能够被银沉淀增强。附加材料（见基本方案；标八的条目见附录1) 生物素化的杂交探针阻断剂： 1 % (m /V ) B S A / P B S V 抗生物素蛋白链菌素溶液 0.1% (V /V ) Tween 20/P B S , 42〇C V 生物素化的H R P 溶液 S 0AU 2O2 D A B 酶底物溶液： 500^g/m l D A B /PBS，新鲜配制’ VPBS V 90% (

24m m X 60m m 盖玻片 42°C 水浴摇床 1. 如以上描述所示，生物素化的探针杂交染色体靶玻片，洗涤（基本方案，第 1〜8 步）。 2. 从 I X S S C 中取出玻片。尽可能地擦干水，但在此过程中任何时候都不能让玻片干燥。加 200^1阻断液，盖上24m m X 60m m 盖玻片。置于铝箔包裹的湿盒中， 37°C 孵育 3Omin〇 3. 取出玻片，并倾斜使盖玻片滑落，去除多余的阻断液。加入 200jul抗生物素蛋白链菌素溶液，盖上盖玻片，湿盒中37°C 孵育30min。 4. 取出玻片倾斜去掉盖玻片，放入42°C 0. l% Tween20/P B S 的染缸中，在 42°C 的水浴摇床上摇5min。再重复洗2 次。 5. 去除水分。加 200M 生物素化的H R P 溶液，盖上盖玻片，湿盒中37°C 孵育30min。第 3〜5 步也可以简化为一步，即用 3jug/ml抗生物素蛋白链菌素- H R P 结合物孵育玻片。 6. 重复第4 步，洗涤。 7. 去除水分。加入1/200体积3 % H 2O 2 (终浓度0.015%)到 D A B 酶底物溶液中。立即加入200julD A B 酶底物溶液，盖上盖玻片，室温下避光孵育10〜20min。 8. 当肉眼可见有色沉淀时，室温下用P B S 冲洗玻片5min终止反应。 9. 如果需要，用荧光复染确认染色体（基本方案第12步）。 10. 9 0 % 甘油或适当的抗褪色剂固定玻片（基本方案第I3 步）。用相差显微镜观察和摄像。备选方案2 用碱性磷酸酶进行酶检测附加材料（见基本方案；标7 的条目参见附录1) V 生物素化的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase， A P ) 溶液 3jug/m l 抗生物素蛋白链菌素-A P 复合物（Life Technologies) V 碱性磷酸酶缓冲液， p H 9.5,42°C V N B T /BCIP酶底物溶液 VPBS V 9 0 % 甘油或适当的抗褪色固定剂 24m m X 60m m 盖玻片 42°C 水浴摇床 la. 多步检测：如以上描述所示，生物素化的探针杂交染色体靶玻片，洗涤，阻断，在抗生物素蛋白链菌素溶液中孵育（备选方案1，第 1-4步）。从 0. 1 % Tween 20/ P B S 中取出玻片，去除水分但不能干燥。加 2004生物素化A P 溶液，盖上盖玻片，湿盒中 37°C 30min。 lb. 单步检测：杂交、洗涤、阻断，然后在3哗/1111抗生物素蛋白链菌素-A P 复合物中孵育。

2•取出玻片倾斜去掉盖玻片，放入42°C 0. 1 % T w een20/ P B S的染缸中，在 42°C的水浴摇床上摇5min。再重复洗2 次。 3•将玻片放入42°C碱性磷酸酶缓冲液中， pH9.5, 42°C摇 5min。重复1 次。 4•将玻片放入盛有50m l 新鲜配制N BT/BCIP酶底物溶液的铝箔包裹染缸中，避光放置，一般37°C 15〜60m m ，或者室温下放置（慢反应）直至颜色显示清楚。 5.室温下， P B S 冲洗玻片5min终止反应。 6•如果需要，用荧光复染确认染色体（基本方案，第 12步）。 7. 90%甘油或适当的抗褪色剂固定玻片（基本方案，第 13步）。用相差显微镜观察和摄像。支持方案3 缺口平移法标记生物素和地高辛探针应用缺口平移法（nick translation) , 探针不需要纯化和线性化。材料（标V 的条目参见附录1) 缺口平移标记试剂盒（如 Boehringer Mannheim) 或类似材料： V 1〇 X 缺口平移标记缓冲液 V g 探针D N A (如插人克隆的质粒、噬菌体、黏粒、 P i 或 Y A C ) lmmol/L 生物素-16-dUTP (biotin-16-d U T P ) 或 lmmol/L 地高辛-11-dUTP (digoxigenin-11-d U T P ) ( Boehringer Mannheim) V I 和 4mg/ml D N A 酶 I (DNase I ) (Worthington) 5U/ml D N A 聚合酶X ，外切核酸酶活性（Boehringer Mannheim) V 〇-5m o l/L E D T A 7 1 0 % (m / V ) SDS ■ V l〇 m g /m l 超声处理的鲑精D N A • V3mol/L 乙酸钠， p H 5. 2 95 % 和 7〇% (V A O 冰冻乙醇 15°C和 65°C水浴 65°C加热阻断 1•将1.5m l 小离心管置于冰上，依次加入： lOjullOX缺口平移标记缓冲液（ I X 终浓度）； Ijug 探针 DNA; 5pl lmmol/L 生物素-16-dUTP 或 lm m 〇 l/L 地高辛-11-dUTP (0• 05mmol/L 终浓度)；加无菌水至IOOjuJ终体积； IOjul lpg/ml DNA 酶 I ; 4jul 5U/ml DNA 聚合酶工。 . 混匀，点离， 15°C孵育2〜2. 5h 。 2 . 从反应产物中取出5； /1煮沸3m in后置于冰上2min (剩下的95^1保存在一20。〇。琼脂糖凝胶电泳检测探针大小（100〜500bp，大部分在250〜300bp)。如果探针DNA

的主要片段>800bp，在反应体系中加人54 I1 LtgAnl的 D N A 酶 I ，继续在15。 (3孵育 30min，再次检测片段大小。 3. 探针片段大小合适时，在反应体系中加入3jlJ 0. 5mol/L E D T A 和 ImI 10% SDS， 65°C 加热lOmin，将酶灭活。 4. 乙醇沉淀探针法：在反应体系中加人I1LJ lOmg/m 丨超声处理的鲑精D N A ， 1/10体积的 3mol/L 乙酸钠和2 I 体积9 5 % 乙醇，一20°C > lh或干冰上lOmin。 5. 4°C ，最大速度离心3〇 m i n ，去上清，用 7〇%冰冻乙醇清洗D N A ^ t淀。空气中干燥，加入200卩1无菌水溶解D N A (终浓度5ng/|ul)。 4°C 储存（稳定性> 1 年）。如果需要 (如大量应用新的D N A 酶 I 和 D N A 聚合酶 I ，获得的杂交信号差），检查混合液 (如见C P M B 单元 3.18) 。备选方案3 通过间期核F I S H 排序间期FISH定位可用于位于相同染色体条带的序列的排序。间期染色质比中期染色质更加松散，在中期染色体分散不佳的探针可以在间期核上排序。至少三个在间期染色质上排列50kb〜I M b 的D N A 探针序列有必要确定相关位置。杂交条件如上所示（基本方案）。间期FISH定位是在G 1或 G 2期细胞上进行，大量的这种细胞一般出现在标准的细胞学上准备收获中期染色体时期。用单个探针杂交可以看到G 1期细胞，每条染色体只有一个信号， G 2期细胞每条染色体（姐妹染色单体）有两个信号。从外周血样本中收集血沉棕黄层制作G 1期细胞丰富的玻片，将收获的细胞低渗、固定、制作玻片（单元4.1)。变性、杂交、检测。用三个探针杂交同一张玻片—两个生物素标记和一个地高辛标记探针、两个地高辛标记和一个生物素标记探针，或一个生物素标记探针、一个地高辛标记探针和双重标记探针。用互补的荧光素观察信号。一般分析25〜50 个间期细胞就可以判断顺序了。如果相邻的探针是相同的颜色 (如红-红-绿），需要改变其中一个探针的颜色再杂交一次，这对确定探针顺序是必要的。这样颜色顺序就变成了红-绿-绿或绿-红-绿。如果第三个探针同时被生物素和地高辛标记，就产生了黄色荧光，红、绿、黄色信号可以直接决定顺序。如果颜色顺序不明显，有可能探针与间期核相隔很远。当两个探针间距离增加时，尤其是在1.5〜3M b ，核内染色质的缠绕非常有可能影响信号的定位。参考文献： Lichter 沒， 1988， 1990; PinkeletaZ.， 1988 编者： Joan H. M. Knoll and Peter Lichter

来源：丁香实验