相关实验：γ 干扰素的检测
最新修订时间：2022-02-10
材料与仪器
步骤
来源：丁香实验
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![多通道移液器 检测板： 96 孔平底 Immulon 2 ELISA 板 和 板 盖 （ Dynatech Laboratories # Oll- 010-3450) 96孔 V 形底微量滴定板 ELISA板 洗 板 器 （可选Bio-Rad 1550) 酶联仪和414nm滤光片 注： Genzyme公司有售包括所有缓冲液、抗体和试剂的试剂盒，可检测人IFN-7 (# 1556-00)或 小 鼠 IFN-7 (# 1557-00) 。 ATCC有售能产生抗小鼠IFN- 7 的特异性 IgG l 单抗的大鼠杂交瘤细胞（RA-6A2 # HB170)。不久将有能产生抗人IFN-7单抗的 其他杂交瘤细胞。 1. 用碳酸包被缓冲液将纯化的抗IFN-7单抗稀释到3. 5Mg/ml。 2 . 用多通道移液器，向检测板的每孔中加人1 0 0 4 单抗稀释液。用板盖盖板， 37°C孵 育 2h 或 4°C放 置 过 夜 （包被过夜可增加敏感性）。 3 . 如下在另一块96孔 V 形 底 板 （稀释板）中系列稀释IFN-7。在 1〜3 列 的 B〜 H 行 的每孔中加125^1样本缓冲液； A 行 加 250MlIFN-7标准品[浓度为100国际参考单 位 （IRU) /ml，含 3.3ng/ml人 IFN-7或 l 〇ng/ml小鼠IFN-7]。用多通道移液器从 A 行各孔分别转移125M1液体到B 行各孔，吹打混匀。如此重复倍比稀释标准品直 到 G 行 各 孔 ，从 G 行 各 孔 吸 弃 125W 液体。 A 〜 G 行 的 浓 度 从 IOOIRUAnl到 0. 78IRU/ml。 H 行是空白对照。 纯化的重组IFN- 7 是最好的标准品。如果先用商品化IFN-7标准品滴定，含 IFN-7的活化T 细胞培养上清液也可作为标准品。标准品和待测样本必须种属相同 且具有相同的单抗特异性。 4•在4〜6 列 ， A 行的每孔加175m1待测样本之一， B〜D 行加140M 1样本缓冲液。用多 通道移液器从A 行各孔分别转移35M 1液体到B 行各孔，吹打混匀。如此重复5 倍稀 释标准品直到D 行各孔，从 D 行各孔吸弃35pd液体。因此待测样本稀释了 125倍， 每个稀释度3 个复孔。 5 . 同样稀释其他待测样本，每个样本3 列X 4 行。 6 . 用 ELISA洗液洗涤已包被的检测板6 次，可 用 ELISA洗板器。如果需要保存，每 孔 加 IOO1Ul ELISA洗液后加盖，检测板可在4°C保存 2 周。 7 . 在吸水纸上拍干检测板。用多通道移液器从稀释板转移IOOmI 稀释液到检测板对应 各孔。 37°C孵 育 Ih 或 4°C放 置 过 夜 （过夜孵育可增加敏感性）。 在洗液中加入Tween 2 0 可减去封闭步骤。 8 . 用 ELISA洗液洗涤检测板6 次，在吸水纸上拍干检测板。 9 . 用样本缓冲液稀释抗IFN-7多克隆抗血清500〜5000倍 ，每孔加IOOmU 加盖后室温 (20〜25°C) 放 置 lh 。用 ELISA洗液洗涤检测板6 次，在吸水纸上拍干检测板。 多克隆抗血清的稀释倍数需要根据经验确定。也可用能对IFN-7标准品产生最 大线性OD反应且最低背景的多克隆抗血清的稀释倍数定为最适浓度。 10. 用样本缓冲液稀释过氧化物酶标记的抗山羊IgG或抗兔IgG抗 体 2000〜10000倍 ， 每孔加100/xl，加盖后室温（20〜25°C) 放 置 lh 。用 ELISA洗液洗涤检测板6 次，](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/A1469530956152u7hpgad7a7png_small.jpg)
