材料与仪器
步骤
基 本 方案 酪 氨酸 蛋白 激酶 的免 疫 沉淀 和自 身 磷 酸化 检 测
以下步骤可以釆用淋巴或非淋巴细胞、原代细胞或培养的细胞系、活化或非活化的细胞。
材 料（带 V 项 目 见 附 录 1)
待检测的细胞 冰预冷的 PBS
含蛋白酶抑制剂的 I X 细 胞 裂 解 液（新鲜配置并于冰上保存）
含蛋白酶抑制剂的 5 X 裂 解 液（细胞活化用，新鲜配制并于冰上保存）
考马斯蛋白检测试剂（Pierce) 或类似试剂
多克隆或单克隆的兔抗 src-相 关 T P K 抗 血 清（U B I 、 Oncogene Science 或 Santa
Cruz Biotechnology)
对 照 血 清（Sigma) : 正 常 的 兔 血 清（如使用多克隆抗血清），或 同 型 IgG (如使用
单克隆抗血清）
Pansorbin ( 1 0 % 福 尔 马 林 固 定 的 金 色 葡 萄 球 菌 ； Calbiochem) ， 或 蛋 白 A /蛋白
G-Sepharose (Pharmacia Biotech)
亲和纯化的兔抗鼠 IgG (如使用单克隆抗体； Organ o n T e k n i k a C a p p e l)
冰预冷的 N P -40 缓冲液
冰预冷的酪氨酸蛋白激酶（T P K ) 缓冲液
l 〇/mi 〇 l/L A T P 溶液，新鲜配制
5m C i / m l [y-32P ] A T P (3000Ci/m m o l ; D u P o n t N E N ) : 在准备反应混合物前
一小时将其在冰上融化
冰预冷的改良 R I P A 缓冲液
I X S D S /上样缓冲液
细 胞 刮 具（用于贴壁细胞）
Labquake 摇 床（PGCScientific)
l 〇〇°C 加热块
W h a t m a n 3M M 滤纸
注 ：除洗涤外，所有的步骤均在冰上或 4°C 冷室进行。
收 集 无 需 活 化 的 细 胞 。
la. 对于悬浮细胞，需室温， 500 g 离 心 I O m i n 收集 ，弃上清，以冰预冷的 P B S 重悬细
胞 。如前所述离心和弃上清。对于贴壁细胞，当 细 胞 贴 壁 时 以 5〜I O m l 冰预冷的
P B S 洗一次，旋动并吸弃 P B S 。于 IO7〜IO8 个 细 胞 加 2〜3m l 冰 P B S ，以细胞刮具
收集细胞。如前所述悬浮细胞的条件离心。如有必要，于一 70°C 保存细胞沉淀，细
胞裂解物不能冰冻（步 骤 5)。
2a. 加 入 I m l 冰预冷的含蛋白酶抑制剂的 I X 细胞裂解液并涡旋混匀，冰上静置 lOmin。
收 集 不 同 时 间 进 程 的 活 化 细 胞 。
![Ib. 将细胞分成每份lml，分 别 以 适 当 的 刺 激 物 刺 激 至 所 需 时 间 （如 单 元 2. 6 和单元 2. 11 ； Eiseman and Bolen, 1992)。 2b. 每份加入255jul冰预冷的含蛋白酶抑制剂的5 X 细胞裂解液，并涡旋混匀，冰上静 置 IOmin0 3 . 将细胞裂解物转移至微量离心管中， 4°C ，高 速 离 心 3m i n 以沉淀不溶物质，将上清 移至新管。 4 . 用考马斯蛋白测定试剂或等同物，对 每 份 1〜5M1裂解液进行蛋白质定量。 5 . 准备两只离心管，各 装 有 100Mg〜I m g 蛋白质，并用含有蛋白酶抑制剂的I X 细胞裂 解液调整体积至500/xl。 6. —管 （样本管）中加入1〜1(^1抗 src-相 关 T P K 抗 血 清 （稀释比例已经优化），加入 等量对照血清至另一管。涡旋混匀并冰浴lh。 7a•若使用多克隆抗T P K 血 清 ：加 50〜100M1 Pansorbin ( 或 50〜IOOmI 蛋 白 A -/蛋白 G -Sepharose) 至每个管子， 4°C置 Labquake振荡器/旋转器上颠倒混合lh。 7b•若使用单克隆抗T P K 血清：加 入 50]ul兔 抗 鼠 I g G 至 Iml Pansorbin ( 或 50〜IOOjul 蛋 白 A -/蛋 白 G -Sepharose) 中， 4°C 颠 倒 混 合 30min。高 速 离 心 30s 洗去未结合的 抗体，加 入 Iml N P -40缓冲液，剧烈涡旋混勻。重复洗涤并重悬于I m l 冰 预 冷 N P - 4 0 缓冲液重悬。加 50M1此混合物至步骤6 的每管中， 4°C 置 Labquake摇床上颠倒 混 合 lh。 8 . 室温，离 心 30s 以沉淀免疫复合物，弃上清。 9 . 洗 涤 沉 淀 （免疫沉淀物） 3〜5 次 ：如前所述，用 I m l 的冰预冷N P -40缓冲液，剧烈 振荡以重悬沉淀，离心。 10. 以 I m l 冰 预 冷 T P K 缓冲液洗涤沉淀，使之与反应缓冲液平衡。 11. 配制激酶反应混合物（每个反应25/xl): 20|Ld T P K 缓冲液 2. 5/xl 10/xmol/L A T P 溶液 2.5^1 [y-32P ] A T P 0 用 25/xl反 应 混 合 物 涡 旋 混 匀 以 重 悬 免 疫 沉 淀 物 ， 室 温 在 Eppendorf混 合 器 上 孵 育 2〜IOmin0 12. 室温，高速离心30s 以洗涤免疫复合物，洗 3〜5 次 。重 悬 于 I m l 冰预冷R I P A 缓冲 液 ，剧烈振荡。将上清弃于放射性废物桶中。 13. 以 50M1 I X S D S 样本缓冲液重悬沉淀，涡旋混匀，室 温 孵 育 15〜30min。室温，离 心 30min，将上清移至新离心管。将沉淀弃于放射性废液容器中。样 品 在 100°C 加 热块上加热5min，微 离 心 15s 以收集所有凝结在管壁上的液体。上 样 ，进 行 8 % S D S - P A G E 电泳。 14. 将胶置于Whatman 3M M 滤纸上在常规的干胶器上干燥，通过放射自显影使蛋白质 显影。](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/A1469516333804ztqvayqfn2png_small.jpg)
备 选 方 案 1 蛋白激酶对外源底物的磷酸化检测
附 加 材 料
![/ 外 源 底 物 （兔 -肌 肉 烯 醇 酶 或 酪 蛋 白 ；根据经验确定类型和用量） V lOOfmiol/L A T P 溶 液 （新鲜配制并于冰上保存） V 2 X S D S /上样缓冲液 凝胶固定剂： 3 •• I : 6 (V /W V ) 甲醇/冰乙酸/水 1 . 如基本方案步骤1〜1 0 制备和洗涤免疫复合物。 2 . 配制激酶反应混合物（每个反应25M1): 10〜194 T P K 缓 冲 液 （至总体积25m 1) 1〜IOjul lmg/m l 外源性底物 2. 5pl 10/xmol/L A T P 溶液 2. 5/xl [y-32P ] A T P 0 用25卩1反应混合物重悬免疫沉淀物，室温在振荡器上孵育1〜5min。 3 . 加 入 25M1 2 X S D S 样本缓冲液，涡旋混匀，室 温 孵 育 15〜30min。室 温 ，高速离心 lmin，将上清移至新管，将 沉 淀 弃于放射性废液容器中。 K K T C 加 热 5min，微离 心 15s〇 4 . 将样本上样至8 % 的 SDS-P A G E 胶 ，电泳。 5 . 将胶在凝胶固定剂中浸泡孵育lh，更换凝胶固定剂继续孵育，将用后的固定剂弃于 放射性废液容器中。 6 . 将胶置于Whatman 3M M 滤纸上在常规的干胶器上干燥，通过放射自显影使蛋白质 显影。](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/A1469516351662n4hdkuj7qnpng_small.jpg)
备 选 方 案 2 蛋白激酶对外源底物的磷酸化检测
附加材料
![lmg/mlRR-SRC 肽 （GIBCO/BRL) 溶于 TPK 缓冲液 V l 〇〇iumol/L ATP 溶液 冰乙酸 1 0 % O V V ) 三氯乙酸 75mmol/L 磷酸 圆形磷酸纤维素滤纸（可采用整张的， GIBCO/BRL) 1 . 如基本方案步骤1〜1 0 制备和洗涤免疫复合物。 2 . 配制激酶反应混合物（每个反应25m 1): 10〜19M 1 T P K 缓 冲 液 （至总体积25m1) 5 〜 20/xl lm g/m l RR-SRC 肽 2. 5M 1 lOOjumol/L ATP 溶液 2.5^1 [y-32P] A T P 0 用 2 5 4 反应混合物重悬免疫沉淀物，室温在 Eppendorf混合器上孵育1〜5min。](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/B14695163662506fixi6qidgpng_small.jpg)
来源：丁香实验
