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    T 淋巴细胞增殖实验

    相关实验：T 淋巴细胞增殖实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    步骤

    基 本 方 案 1 未 致 敏 T 淋巴细胞的活化

    材 料

    R P M I -5和 R P M I -I O 完全培养基 反应细胞：未免疫小鼠胸腺、脾脏或淋巴结来源的淋巴细胞（单 元 2 . 1 ) 或纯化的 T 淋巴细胞或T 淋 巴 细 胞 亚 群 （单 元 2.1 和单元2. 2) 活 化 试 剂 （表 2. 11.1) V PBS 辅助细胞：经射线照射或用丝裂霉素C 处 理 过 的 （见 辅 助 方 案 2 ) 或 T 细胞剔除 的 （见辅助方案1 ) 小鼠脾脏细胞悬液 3H T d R (附录 3E ) 15m l 和 4m l 聚苯乙烯锥底离心管 带 Sorvall H -1000B 转子的低速离心机（或相当于此型的离心机） lml、 5m l 、 IOml—次性聚苯乙烯吸管 带 盖 9 6 孔平底或圆底培养板（Coster) 25〜IOOiUl单道或多道移液器和一次性枪头 1 . 按照单元2.1所述，用 R P M I -5 完全培养基制备来源于小鼠胸腺、脾脏或淋巴结的 反应细胞悬液，收集的细胞数量应保证后续实验所需（每种器官的细胞数量见单元 2. 1 ) 0 2 . 用 15m l 离心管室温， 200g 离心单细胞悬液lOmin，弃上清。 3 . 用 R P M I -5完全培养基重悬细胞团块，计 数 并 用 R P M I -I O 完全培养基调整细胞约为 IO6 个细胞/ml (可参比预实验中每孔2 X IO5、 4 X IO5 和 8 X IO5 个细胞的结果调节 细胞浓度），如果用高度纯化的T 细 胞 或 T 细胞亚群作为反应细胞，需根据激活剂 的 不 同 （表 2. 11 . 1 ) 加 入 相 应 的 非 T 辅 助 细 胞 （如 0.1 X l O 5、 0.5 X IO5 或 I X IO5 个细胞/0.1m l 同型脾细胞，加 人 到 2 X IO5 个细胞/0.1m l 的 T 细胞中，见辅助方案 1)。如果比较不同细胞群体的反应性，需对活化剂和反应细胞进行滴定并做动力学 实验。 4 . 按以下方法于室温在4m l 的离心管中配制工作浓度的活化剂。单 克 隆 抗 体 （如果来
    自上清或腹水，至少使用四种稀释度）、毒 素 （确认使用的小鼠表达能够结合毒素的 1^^[(： 11分子）或凝集素：用 ？： 83将111^/1111储存液进行四种稀释度，如100] ^/1111、 30Mg/ml、 10Mg/m l 和 3Mg/m l ，由于蛋白质会结合到塑料上，因此稀释后应马上使 用 。对于药物，用 P B S 配制成合适浓度即可，如 P M A ， lOOng/m l ; A 23187, Iyg/ ml (或 4/xg/m l 离子霉素）。 5 . 加 入 2〇 4 各种不同稀释度的活化剂（单抗、肠毒素或凝集素）至 96 孔平底或圆底板 中，设 置 3 个 复 孔 ，如每种激活剂用一行。对 照 孔 加 入 20M1 P B S 。由 于 P M A 和 A 23187的剂量-反应曲线很窄，所以只需用一个浓度，即 加 入 第 4 步中给出浓度的 2〇 W P M A 或钙离子载体。 6 . 在含有活化剂的9 6 孔板中加入2 X I O 5 个细胞/0. 2m l 。 7 . 将 9 6 孔 板 置 37°C ， 5 % C 0 2 的培养箱中培养2〜4d (依经验决定培养时间）。 8 . 每孔加入3H T d R ，然后 置 C O 2 培养箱中继续培养18〜24h ，用半自动样品收集器收 集样品，并 用 P 液闪仪检测cpm值 。 9a. Acpm值 （大部分文献推荐）：用 实 验 组 （刺激组）三 个 复 孔 的 cpm 平均值减去对 照 组 （未加刺激剂组）三个复孔的平均值，得出实验组的Acpm值 。 9b. 实验组和对照组cpm 的比值：实 验 组 cpm 的平均值除以相应对照组的cpm 平均值 (结果表示为刺激指数或SI)。 注 ：本底的微小变化将引起SI值的很大变化，在分析结果时应特别注意。

    备选方案1 用抗体激活未致敏的T 细胞

    这种方法适用于当抗C D 3/T C R 复合物抗体不能有效结合小鼠辅助细胞上的F c 受体 ，或其可溶形式不能有效活化T 细胞时。值得注 意 的 是 ，在 某 种 抗 体（如 抗 G 7、Thy-I 单克隆抗体）很难诱导T 细胞增殖反应的情况下，推荐采用基本方案1。

    附 加 材 料

    P B S (室温和 4°C )

    用 P B S 配 制 lm g /m l 纯化的抗C D 3 或 抗 T C R 单 克 隆 抗 体（非特异性活化T 细胞)或 lmg/m l 纯 化 的 抗 V 卩或抗T C R -y S 单 克 隆 抗 体（特 异 性 激 活 T 细胞 ，表
    2.11.1)

    1.在 4 ml聚苯乙烯圆锥底离心管中，用 无 菌 室 温 PBS (不含蛋白质）将 lmg/ml无菌的 单 克 隆 抗 体 储 存 液（表 2.11.1)，根 据 实 验 需 要 配 制 4 个 浓 度 的 工 作 液 ：如lOOug/ml、 10ug/ml、 1ug/ml、 O.lug/ml， 临用前配制。

    2 .加 30ul各浓度的抗体工作液（每孔最多结合2〜3 ug ; 最佳浓度通常为10ug/ml) 至9 6 孔 圆 底 板 中（每种单抗使用一行），用 30/xl P B S 作为对照孔。

    3 . 盖好板盖，轻拍培养板侧面确保液体完全覆盖孔底。 37°C 培 养 90 min，或 者 4°C 培养过夜。培养的同时进行下一步操作。

    4 . 同基本方案1 中的步骤1〜3 , 制 备 反 应 细 胞 悬 液（可高度纯化，但其中的辅助细胞并不影响实验结果）。

    5 . 每孔加 入 200ul预 冷 的 P B S 洗涤上述抗体包被的培养板孔，在超净台中将培养板反转倒扣于吸水纸上轻拍，除去残余的液体，重 复 洗 涤 2 或 3 次 ，确保除去多余的抗体。

    6 . 在洗好的板中加入准备好的细胞悬液2 X 105 个细胞/ (0.2 ml •孔）（根据经验来确定 ，不能用杂交瘤上清）。如果细胞暂时未准备好，可 加 100M P B S 后 置 4°C 保存过夜（加细胞前应去掉P B S )。

    7 . 按基本方案1 中的步骤7〜9 进 行 ，在 培 养 2〜3d 后（进行动力学实验确定最佳时间）加入3H TdR。

    备选方案 2 混合淋巴细胞增殖实验

    附 加 材 料

    反应细胞：未免疫小鼠胸腺、脾或淋巴结的淋巴细胞（附 录 2H 和 单 元 2 . 1 ) 或者 纯 化 的 T 淋巴细胞或T 淋 巴 细 胞 亚 群 （单 元 2. 1 和 单 元 2. 2)。 刺激细胞：与反应细胞在H -2或 M l s 位点不同的同种异体小鼠脾细胞，经照射或 用丝裂霉素C 处 理 （见 辅 助 方 案 2 ) 或 剔 除 T 细 胞 （见 辅 助 方 案 1)。照射或 用丝裂霉素C 处理可阻断丁细胞摄取3H T d R 。 1 . 按照基本方案1 中 步 骤 1 〜 3 准备反应细胞。一 般 来 说 ，需 分 别 稀 释 成 每 孔 0.5 X 105、 1 X 1 0 5、 2 X 1 0 5 和 4 X 1 0 5 个细胞，各浓度设置3 个 复 孔 （通常后两个细胞浓度 孔可产生最佳的增殖反应），若使用胸腺细胞，需 更 多 的 细 胞 数 量 （如 每 孔 1 X 1 0 5、 2 X 1 0 5、 4 X 1 0 5 和 8 X 1 0 5 个细胞）。 2 . 每 孔 加 0. 55X 105〜4 X 105 个细胞/0. I m l 反应细胞至9 6 孔板，如需要，每个实验组 设 置 3 个复孔。 3 . 制备经照射灭活或用丝裂霉素C 处理的刺激细胞悬液，或 者 T 细胞剔除后的刺激细 胞悬液。根据经验来确定刺激细胞的最佳浓度（如 每 孔 2 X 105、 4 X 105、 9 X 105 个 细胞），每 孔 加 0.1m l 细胞悬液至含有反应细胞的孔中。对照组包括：反应细胞与经 照 射 或 用 丝 裂 霉 素 C 处理的与反应细胞同基因小鼠来源的刺激细胞的共培养复孔 (本底值）、单独的刺激细胞和单独的反应细胞。 4 . 参照基本方案1 中步骤7〜8 进行，但需培养3〜6d (根据经验确定培养时间）。

    辅助方案1 从抗原呈递细胞或刺激细胞悬液中剔除T 淋巴细胞

    这一方法的主要目的是排除辅助T 细胞的影响。纯化和富集抗原呈递细胞的方法见相关章节；单 元 2. 3 中介绍的方法未剔除T 细胞，因此不推荐使用。

    附 加 材 料（其 他 材料 见 基 本 方案 1）

    与反 应 T 细胞同基因的未免疫小鼠脾细胞

    H B S S

    低 毒 兔 补 体（Cedarlane) ，用冰冷无菌的去离子水稀释

    抗 Thy-l.2单 抗（H 〇 -13-4， A T C C n o . TIB9 9 ) 或 抗 T h y-l.l 单 抗（H 〇 -22-l ，A T C C n o . TIB1 0 0 ; 或其他抗-Thy-I 单 克 隆 抗 体 见 C P I M 表 3. 4. 1 和腹水制
    备见单元1. 4) V 70% Percoll 溶 液 （单元 2. 5) 1 . 离心、沉淀脾细胞悬液。 2 . 弃上清，在沉淀中加入0.9ml H B S S ， 0.1m l 补 体 和 25/xl抗 Thy-I 单 抗 ，混合后置 37°C 水浴 45min。 3 . 室温， 200g 离 心 lOmin，弃上清。用 H B S S 重悬沉淀，并 洗 涤 2 遍 以 上 ，计数活细 胞 （附 录 3 0 , 加 入 R P M I -I O 完全培养基或I3B S , 按 照 辅 助 方 案 2 灭活细胞，或用 H B S S 悬浮细胞制备低密度辅助细胞（见下面）。如果需要，可分离该群细胞以提高 辅助 细 胞 的 功 能 （步 骤 4〜5)。 4•用 23. 58ml 7 0 % Percoll 与 6. 42ml H B S S 混合配制 55 % 的 Percoll 液 ，用 H B S S 悬浮 步 骤 3 中剔除T 细胞后的脾细胞，调整细胞浓度为20X 106 个细胞/m l 。在 15m l 锥 底离心管中，将 3m l 细 胞 悬 液 叠 加 至 3m l 5 5 % PerC〇ll的液面上，室 温 ， 1900g 离 心 13min0 5 . 用巴氏吸管移出Percoll/H B S S 界面层细胞，用 H B S S 洗 涤 3 遍 。记数活细胞数，用 R P M I -I O 完全培养基重悬细胞并根据辅助方案2 灭活细胞

    辅助方案2 辅助/刺激细胞的灭活

    注 ：当 需 要 检 测 基 因 编 码 的 抗 原 性 差 异 或 没 有 辐 射 射 源 时 ，多数研究者优先采用丝裂霉素 C 灭活细胞。

    丝裂霉素C 灭活细胞

    附 加 材 料

    丝裂霉素C (Sigma，避光保存） 1 . 在铝箔包裹的15m l 试管中，用 P B S 配制浓度为0.5m g /m l 的丝裂霉素C 溶液 ，并过 滤除菌。临用前新鲜配制。 2 . 按照基本方案1 中步骤1 和 2 , 用 P B S 制 备 5 X IO7 个细胞/m l 脾细胞悬液。 3 . 加入丝裂霉素C 至终浓度为5(^g/m l ，并用铝箔包裹试管，置 37°C 室 温 20min。 4 . 加入过量的R P M I -5完 全 培 养 基 （大 约 12m l 可以加满试管）， 300g 离 心 lOmin。弃 上清，并重复洗2 遍以上。 5 . 用 R P M I -I O 完全培养基重悬细胞，计数细胞，调整细胞至 需 要 的 浓 度 （见基本方案 1 ，步 骤 6)。 照射灭活细胞 按照基本方案1 中的步骤1〜3 , 用 R P M I -I O 完全培养基制备脾细胞悬液，终浓度 为 5 X 106〜20X 106 个细胞/m l 。用 辐 射 源 （6 gC o 或173Cs 7-辐射器，如 Gammacel 1000、 Nordion) 1000〜2000rad照射灭活细胞。 这一辐射范围适用于大多数免疫学实验中脾细胞的灭活。然而，不同脾脏细胞照射 后 ，其抗原呈递能力有所不同（AshwelUr W .， 1984):低 辐 射 时 （500〜IOOOrad)， B

    细胞维持抗原呈递功能； 1100〜2000rad辐射后，抗原呈递能力大幅度下降；> 2 0 0 0 m d灭 活 的 B 细胞失去 A P C 功能。而另一方面，巨噬细胞和树突细胞在 3000rad 照射后依然保持抗原呈递的功能。为 确 保 B 细胞不参与应答，一些研究者倾向于采用 2000rad。然而，在检测刺激细胞 M l s 位点抗原时，应采用< 1000m d 的辐射，因 为 此 时 B 细胞能够更为有效地呈递 M l s 抗原。另外 ， M l s 应答也可在丝裂霉素C 处理后进行检测，处理 后 的 B 细胞依然保持抗原呈递的功能。

    在转化的细胞株用作抗原呈递或辅助细胞时，需使用高强度的照射从而阻断其增殖 。每种细胞株适合的辐射强度需要根据预实验来确定，但 至 少 应 达 5000rad; 某些转化的细胞株可能需要高达 10 〇〇〇〜20 OOOrad，或 有 些 细 胞 株 可 能 对 丝 裂 霉 素 C 更为敏感。

    基本方案2 致敏T 细胞的活化

    材 料

    R P M I -5和 R P M I -10完全培养基 反应细胞：从体内致敏的小鼠淋巴结（单 元 2.1和单元2. 2 ) 分离纯化的T 细胞 抗 原 ： lmg/m l 灭 菌 的蛋白质抗原（单 元 2. 12)，溶 于 P B S 或溶于R P M I -10完全培 养基的经辐射或丝裂霉素C 处理表达异型抗原的刺激细胞， 8 X 106 个细胞/ml (单元2. 1 0 辅助方案） 辅助细胞：经辐射或用丝裂霉素C 处 理 的 （或剔除T 细胞的）与反应T 细胞同基因 的脾细胞悬液5 X 1 0 6 个细胞/ml，悬 于 RPMI-10完 全 培 养 基 （见辅助方案1) 4m l 的锥底离心管 带 盖 9 6 孔平底培养板 1 . 按照基本方案1 中的步骤1〜3 , 准备反应细胞。 2 . 在 4m l 的锥底离心管中，用 R P M I -10完全培养基配制4 个不同 稀 释 浓 度 的 抗 原 （如 100pg/m l 、 10/xg/m l 、 1/xg/m l 、 0 •lpg/ml 的抗原和 8 X 106、 4 X 106、 2 X 106、 I X IO6 个细胞/m l 的刺激细胞）。按 304/孔 （蛋白性抗原）或 100/xl/孔 （细胞性抗原） 将抗原加到9 6 孔板。每个实验组设3 个复孔，包括只加培养基不加抗原的对照组。 3 . 加 反 应 T 细 胞 0.1ml/孔 ，如果使用致敏小鼠的淋巴结细胞，则 每 孔 加 I X l O 5〜 2 X IO5 个细胞直接进行基本方案1 中的步骤6 。 如果使用蛋白质抗原特异性的纯化的淋 巴 结 T 细胞，每孔加入 5 X 1 0 5 ( 0 . 1 m l ) 个与反应细胞同基因型的辅助脾细胞。 4 . 以下实验同基本方案1 中的步骤7〜9 , 可通过动力学实验确定培养时间（应答通常

    在 第 4 天 或 第 5 天达到髙峰）。

    基本方案 3 C D 4+C D 25+T 细胞的活化和抑制功能的检测

    材 料

    0 0 4 + 002 5 — 和〇 04+ 0 0 2 5 + 丁 细 胞 （单元2.2) n/ R P M I -I O 完全培养基 辅助细胞： T 细胞剔除的经辐射灭活的脾细胞悬液（单 元 2. 2 , 辅 助 方 案 1) 纯化的抗C D 3 抗 体 （B D PHarmingen) 小鼠或人 IL-2 (PeproTech 或 Roche) 纯化的抗C D 2 8 抗 体 （BDPHaraiingen) 3H T d R 带 盖 9 6 孔平底培养板 37°C ， 5 % C 0 2 的培养箱 半自动样品收集器 P 液闪仪 1 . 按 单 元 2. 2 所 述 ，用 R P M I -I O 完 全 培 养 基 分 别 配 制 C D 4 + C D 25—和 C D 4 + C D 25+ T 细胞悬液，计 数 并 调 整 C D 4 + C D 25+和 C D 4 + C D 25+T 细胞浓度分别为IXlO6 个细 胞/ml0 2 . 按辅助方案1 或 单 元 2. 2 所述，用 R P M I -I O 完全培养基准备辅助细胞，计数并调整 细胞浓度为IXlO6个细胞/ml。 3•用R P M I -10完 全 培 养 基 配 制 以 下 抗 体 ：抗 C D 3 ， l| ug/m l ; IL-2， 200 U /m l ; 抗 C D 28? 2jLtg/ml〇 4 . 每 孔加C D 4+C D 25— T 细 胞 50]ul至 9 6 孔平底板中，共 9 孔 。或 每 孔 加 C D 4 + C D 25+ T 细 胞 50M1，共 9 孔 。 5 . 每孔分别加50m 1辅助细胞和50]ul浓 度 为 lfxg/m l 抗 C D 3 抗体。 6 . 在 其 中 3 孔 C D 25— 和 3 孔 C D 25+细胞中，分 别 加 50/^1浓 度 为 200 U /m l 的 IL-2。 7 . 在 另 外 3 孔 C D 25— 和 3 孔 C D 25+细胞中，分 别 加 50M1抗 C D 2 8 , 每组的剩余3 孔加 5〇 W 的 R P M I -10完全培养基。 8 . 在 9 6 孔 板 中 每 孔 加 入 50M1 C D 4 + C D 25+丁 细 胞 ，做 3 或 4 个 两 倍 系 列 稀 释 C D 4+ C D 25+T 细胞，包括仅含50M1完全培养基的对照孔。每个稀释度设3 个复孔。 9 . 在 步 骤 8 的各孔中每孔加50pd C D 4+C D 25— 细胞、 50M1辅助细胞和50jul浓 度 为 I iUg/ m l 的 抗 C D 3。 10. 将培养板置37°C ， 5 % 〜7 % C 〇 2 的培养箱中培养3d (约 66h)。 11•第3 天 ，每孔加3H T d R ，继续培养6〜8h ，用样品收集器收集细胞，并 用 p 液闪仪 测 量 cpm值

    备选方案 3 C D 4+C D 25+T 细胞抑制功能的两步法检测：短期活化和扩增

    C D 4+C D 25+T 细胞并分析其抑制功能

    附 加 材 料

    B S 从 T C R 转基因小鼠中分离、纯化的C D 4+T 细胞 与转基因T C R 对应的蛋白肽 带 盖 2 4 孔平底培养板 1 . 按 单 元 2. 2 所述，用 含 有 lOOU/ml I L -2 的 R P M I -I O 完全培养基纯化C D 4 + C D 25+ T 细胞，计数并用含IL-2的完全培养基调整细胞浓度至I X l O 6 个细胞/m l 。 2 . 用 P B S 配 制 5Mg /m l抗 C D 3抗体。在 2 4 孔板每孔中加入300M1抗体溶液。根据预期 C D 4+ C D 25+ T 细胞收获量来估计抗体包被孔的数目。在 37°C ， 5 % 〜 7% CO2 的培 养箱中培养90min。 3 . 吸弃板中的抗体，并 用 P B S 洗 2 遍以除去残余的抗体。 4•加入Iml (I X l O 6 个） C D 4+C D 25+T 细胞。在 37°C ， 5 % 〜7 % C O 2 的培养箱培养 3d ，使细胞完全活化但尚未大量扩增。 5. 3d 后 ，用 含 1 0 0 U /m lIL -2 的 R P M I完全培养基将细胞按1 : 3 或 1 : 4 传代，后重置 于 37°C ， 5 % 〜7% CO2 的培养箱培养， 3 〜4d 内使用，否 则 ，每 隔 3 〜4d ，用含 100U /m l I L -2 的 R P M I完全培养基传代。 6 . 剧烈吹打收集活化的C D 4+ C D 25+ T 细胞。 4°C ， 200g 离 心 lOmin，洗 涤 2 次彻底除 去残留的 I L - 2 , 并 用 R P M I完全培养 基 重 悬 C D 4 + C D 25 + T 细胞，调整细胞浓度至 I X l O 6 个细胞/ m U 7 . 按基本方案3 中的步骤8〜11，检 测 C D 4+C D 25+T 细胞的抑制功能，这些细胞在抗 C D 3 的存在下可被重新活化。 8 . 根据单元2. 2 用 R PM I-IO 完全培养基制备T C R 转基因小鼠的C D 4 + T 细胞悬液。计 数并调整 CD4+细胞浓度为I X lO 6 个细胞/m l。 9 . 按辅助方案1 或单元2. 2 所述 ，用 RPM I-1 0 完全培养基制备辅助细胞，计数并调整 细胞浓度为I X lO 6 个细胞/m l。 1 0 . 用 R PM I-IO 完全培养基，制 备 4 倍最佳终浓度的抗原溶液。在实验前预先滴定抗 原的浓度，使用能产生60 OOO〜120 OOOcpm的抗原剂量。 1 1 . 在 9 6 孔 板 的 3 个孔中加入SOjLtl CD4+CD 25+T 细胞。做 3 或 4 个 2 倍稀释的CD4+ CD25+T 细胞。对照孔只加入5〇W R P M I-IO 完全培养基。 1 2 . 每 孔 加 50M1 T C R 转基因的C D 4 + 细胞、 50M1 的辅助细胞和50/xl的抗原。 13. 按基本方案3 中的步骤1 0 和 1 1 进行。
    ​

    来源：丁香实验

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