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    扩增和分析 DNA 池实验

    相关实验：利用 DNA 池技术进行纯合子定位实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    受累和对照个体的DNA样品
    TE 缓冲液 短串联重复多态引物（STRP) 10 X 储存缓冲液 4dNTP 混合液 Taq DNA 聚合酶 轻矿物油 去离子甲酰胺载样缓冲液 Rain-X (UNELKO) Binding solution
    96孔 PCR板 0. 5ml 离心管 热循环仪 变形聚丙烯酰胺凝胶电泳仪器

    步骤

    1.根据吸光光度值将每个个体的DNA用 T E 缓冲液稀释到lOOng/jul，然后再测一次以 确保样品浓度为lOOng/julilO ng/jul。 2. 利用一对或者两对STR P引物对每个DNA样品进行PC R 扩增，以确保所有样品都 等量扩增。 3. 把等量的患者DNA混合在一起，每个个体2/xg溶解在20/J 水 中 （ 这些足够完成一 次 IOcM密度的基因组扫描） ，这样得到lOOng/^l 的 浓 度 （ 这里是总体的DNA 浓 度 ，不是每个个体的DNA浓度） ，然后通过加人4 倍体积的水稀释到20ng/jul。 4. 用同样的方法将正常对照的DNA样品混合在一起，同样稀释到20ng/ V l。 5. 将不同的DNA池中的样品2 4 (40ng) 加入到单个的孔或者0.5m l的离心管中。如 果对所使用的STRP引物的等位基因模式不熟悉，可以通过增加一个对照：加入一 个个体的20ng D N A 以便于解释DNA池的等位基因模式。 6•处理好包含每对引物浓度为I .25pmol/L 的引物混合物（ 如果STRP扩增的片段大小 不重叠，那么可以把两对或者多对引物放在一起进行扩增） 。 7. 准 备 PCR体 系 （ 对 于 96个反应） ： 10 X 储存缓冲液IOOjLtl; 2. 0mmol/L 的 4dNTP 混合液 125jnl; ddH20 3^5^1; • 5|ul 5U/jul 的 Tag DNA 聚合酶。 8. 将上述的PCR溶液加入6/J 到 96孔板的孔中，每个孔中还有D N A 和 STR P引物， 共 有 如 果 热 循 环 仪 没 有 热 盖 则 在 每 个 孔 中 加 入 轻 矿 物 油 ，按照下述条件进行 PCR扩增。 预变性: 94〇 C , 3min 35 个循环： 94°C ， 30s 55°C , 30s 72。。， 30s 9. 准备好用来进行聚丙烯凝胶电泳的玻璃板，用 Rain-X 或 者 Sigmacote处理长胶板， 用结合溶液处理短胶板。 10. 准备6 % 的聚丙烯酰胺凝胶（ 丙烯酰胺和双丙烯酰胺之比为19 : 1 ; 附录3F)，等胶 聚合后，以 60W 预电泳10min。 11. 上样前，将样品用水浴或者95°C 热 激 3min，然后马上置于冰上，每孔点样量为 4 4 , 患者和对照的样品交替点样以方便比对等位基因模式，恒 功 率 60W 电泳 Ih 45min〇 12. 银 染 （ 单 元 2 . 1 ) 和通过比较患者和对照的胶图得到结果。牢记以下几点已得到正 确的与疾病基因连锁的STRP
    a. 考虑遗传模式。 DNA池技术对于患者来源于共同祖先从而可能在疾病位点纯合 的常染色体隐性遗传病最为适用。在这种情况下，在和疾病位点紧密连锁的 STRP标记出，在患者DNA池中，应该只看到一种优势等位基因。 b . 考虑家系结构。在标记和疾病基因位点之间的重组会根据重组事件所处的位置 导致患者DNA池出现不同的等位基因模式。例如，在一个父母是一级表亲的核 心家系中，发生在父母和一个后代之间的重组事件会产生一个占绝对优势的等 位基因和另一个等位基因（ 这个等位基因只在一个个体内出现） 。然而，如果重 组事件发生在上一代之间，那么就会导致在患者DNA池中出现两种等量的等位 基因，因此对于一个给定的家系，考虑好等位基因的模式是很重要的。 c. 考虑与之邻近的标记数据。如果一个标记与疾病基因连锁，那么与之邻近的标记 应该会有提示性的信息。一组提示连锁的标记远比一个提示连锁的标记说明作 用大。 d. 识别没有信息含量的标记。在对照中指出现一种条带的标记是没有信息含量的。 一次基因组扫描没能鉴定出连锁区域，应该使用该标记附近的其他STRP进行 分析。

    来源：丁香实验

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