细胞毒性 T 淋巴细胞的诱导及检测

相关实验：细胞毒性 T 淋巴细胞的诱导及检测

最新修订时间：2022-02-10

材料与仪器

步骤

基本方案 1 从 C TL 前体中诱导细胞毒性

注意：反应细胞应根据抗原的种类选择是否需要进行体内致敏。

材料

反应细胞来源：未致敏的或者体内致敏的小鼠脾脏细胞（见辅助方案 1 和 2

致敏培养基

刺激细胞来源：未修饰或半抗原修饰的小鼠脾脏细胞（见辅助方案 3)

R P M I -1 0 完全培养基

H B S S 溶解的 0.5m g / m l 丝裂霉素 C (避光保存）

刀豆蛋白 A (选用）：以 or 甲基-D -甘露糖苷中和后加上清至培养细胞中

IL-2 (选用）

带有旋盖的 15 ml —次性聚苯乙烯圆锥管（如 Falcon)

2 4 孔平底微量滴定板， 2m l 容积，带盖子（如 Costar)

注：实验小鼠应避免影响实验结果的感染，如 m y c o p l a s m a 和免疫抑制性病毒（如

10.按如下方法收集不贴壁细胞（反应细胞的回收率为5 0 % 〜1 0 0 % ) 。用 5m l 或 IOml 一次性移液管将细胞转移至另一个15m l 圆锥底管中，室温， 200g 离心 5min，随后用 R P M I -10完全培养基混悬细胞至I X l O 6〜5X 106 个细胞/m l ，将盖子拧紧。室温放置（至少可保存4h) 或冰上保存直到用51Cr释放法（见基本方案 2 ) 或 D N A 降解法（见备选方案1 ) 检测 C T L 活性。

基本方案 2 络释放法分析 CTL 活性

材料

靶细胞，如脾脏淋巴母细胞（按上述方法活化）的单细胞悬液、适当 M H C 表型的组织培养细胞或者肿瘤细胞，如 P 815 (H -2d)、 E L 4 (H -2b)、 L K (H -2k)，可从 A T C C 获得对照靶细胞（除抗原表达外与靶细胞相同的细胞） V R P M I -10完全培养基（无需抗生素） V 致敏培养基有丝分裂原溶液（选用 •，用于制备脾脏淋巴母细胞）： lmg/ml C o n A 的 P B S 溶液，或 lmg/ml L P S 的水溶液（分别用来刺激脾脏T 细胞和 B 细胞）约 I m C V m l N a ^ C r O 4 的等渗溶液，灭菌并且不含致热原（200〜SOO^ xCi/^g ; D u - Pont N E N 或 A m e r s h a m ) 胎牛血清（F B S ): 56°C 热灭活 Ih 效应细胞（包括 C T L ; 见基本方案1) 对照效应细胞（未致敏的脾脏细胞或无关抗原致敏的脾脏细胞） 2 % (V /V ) Triton X -100 水溶液 25c m 2 组织培养平皿（如 Corning) 2 4 孔平底微量滴定板， 2m l 容积，带盖子（如 Costar) 尼龙滤网， 122叫1孔径（选用； Tetco) 带有旋盖的15ml —次性聚苯乙烯圆锥管（如 Falcon) 多通道上清收集系统（Skatron) 9 6 孔带盖圆底微量滴定板，适用于上清收集系统（Costar) 多通道移液器（50〜200/xl)，带一次性枪头 51Cr 计数管（Skatron) 警告：操作51C r 试剂和51C r 标记细胞时应遵守标准放射安全操作规范。 1 . 用 R P M I -I O 完全培养基制备靶细胞的单细胞悬液（单元 2.1)。如采用脾脏淋巴母细胞，将约 5 X 106 个/m l 脾脏细胞（体外）加入约 2/xg/ml C o n A 或者约 lOjug/ml LPS (均用致敏培养基稀释）分别用来刺激T 细胞和 B 细胞。将脾脏细胞在 25cm2 直立组织培养瓶（< l〇m l 细胞）或 2m l 平底微滴定板（2ml/孔）中， 37°C 饱和湿度， 5 % C O 2 培养箱中培养2〜3d 。用同样方法制备阳性和阴性对照细胞（每次实验必须)。另一种在第 0 天收集脾脏细胞作为刺激细胞（见基本方案 1 ，步骤 2 ) ， 2 〜 3 d 后

收集脾脏细胞作为把细胞的方法如下。在第 0 天同时收集作为刺激细胞和把细胞的脾脏细胞。将靶细胞放在培养瓶中拧紧盖子 4°C保存； 2〜 3 d 后按步骤 1 中方法加入有丝分裂原，拧松瓶盖后放 CO2 培养箱中培养 2〜 3d。 2•将细胞转移至15m l 圆锥管中，加入 14ml R PMI-IO完全培养基，室温，约 200g 离心 5m i n 洗一遍。弃上清。 3 . 用 5ml R PMI-IO完全培养基混悬细胞。放置数分钟使细胞团块沉淀或用单层112/^m 尼龙滤网放置在15m l 圆锥管敞开的管口，过滤细胞悬液（用移液器枪头压下滤网形成小的漏斗；如难以形成漏斗则改用50m l 圆锥管）。 4 . 用台盼蓝拒染法确定未沉淀细胞或滤过细胞中活细胞数（附录 3C ; 实验所需活细胞比例为> 8 0 % ) 。必要时采用Ficoll-Hypaque密度离心（单元 2 . 1 ) 纯化活细胞，但要注意，从活细胞比例低的群体中纯化的活细胞通常比从比例高的群体中纯化的活细胞更容易发生51Cr渗漏。 5 . 在一个 15m l 圆锥管中离心< 5 X 106 个细胞，室温， 200g 离心 5min。丢弃大部分上清，留下细胞团块上约0.1m l 的上清。 6 . 用留下的R P M I -10完全培养基轻轻混悬细胞。加入 0.2ml [ 少量即可（如 0.05〜 0. Iml) ] 约 lmCi/m l 51Cr溶液（标记肿瘤细胞和培养细胞时< 2 0 0 MCi/iLtl即可）和 2(V 1 F B S 。轻轻混匀，将培养瓶盖拧松放37°C ， 5 % C 0 2 培养箱孵育，淋巴细胞孵育约 45min，肿瘤细胞孵育1〜2h ，孵育期间轻轻混匀细胞可提髙标记效果。利用孵育时间进行步骤7 操作。 7 . 按步骤 2〜4 制备效应细胞，用 R P M I -10完全培养基混悬至IO7 个细胞/ml。制备与效应细胞仅存抗原特异性不同的对照细胞（未致敏细胞或无关抗原致敏细胞）。每种效应细胞用R P M I -10完全培养基进行3 倍梯度稀释。 8 . 将 0.1m l 效应细胞（C T L 或非裂解性细胞）或对照细胞加至9 6 孔板中，每个效应细胞浓度设 3 或 4 复孔。用预期的 C T L 活性计算不同的效应细胞浓度，如效靶比 (E : T )100、 20、 10、 3 (通常活化的C T L 在 E : T < 1 : 1 时即可检测到细胞裂解）。注意，细胞浓度大于2 X I O 6 个细胞/孔通常会抑制活性。 9 . 按步骤 2 的方法加入14ml R P M I -10完全培养基洗涤51Cr标记细胞 2 或 3 遍，将上清全部吸出并收集到装放射性废物的容器中（离心中应盖上管盖）。用 R P M I -10完全培养基混悬标记的靶细胞至IO4〜IO6 个细胞/m l 。迅速进行步骤1 0 操作。 10. 将 0.1m l 步骤 7 制备的51C r 标记细胞（即足以产生高于背景^ lOOOcpm的细胞数）至装有如下一种细胞的各个孔中，使终体积达到〇 .2ml/孔： 0. I m l 效应细胞（洗后尽快加入靶细胞） 0.1m l 对照淋巴细胞（步骤 8 注解） 0.1m l 培养基（检测自发51C r 释放） 11. 为促进效靶细胞间的接触，用培养板架将培养板在约200g 离心约 30s。 37°C 饱和湿度， 5 % C O 2 培养箱中孵育3〜6h (取决于实验目的、效应细胞活力，以及靶细胞 51Cr释放的敏感性；也可以培养过夜）（室温结合， 37°C 裂解）。 12•将培养板在约200g•离心5min。将 0 •Iml Triton X -100 (裂解剂）加入装有 0 •Iml 靶细胞的几个孔中，用移液器混匀后检测可释放的最大51& 。用多通道移液器每孔

收集 0.1m l 上清至51C r 计数管中（挂壁液体可忽略），或者用上清收集系统收集全部上清。 . 用 7 液闪仪对51C r 进行计数，每个样品 1〜2min，或加入闪烁液用 p 液闪仪进行计数。 . 计算每一效应细胞浓度的校正裂解百分比，采用各复孔cpm 的均数： / 实验组51C r 释放一对照组51C r 释放校正裂解百分比乂一l o o x 蕞天.5^ 7 驛-琢二 ^ 照组 51(>释放实验组代表具有C T L 活性的效应细胞，对照组代表非裂解细胞（材料部分称之为 “对照效应细胞”；对照组释放也称为“自发释放”）或者无细胞的培养基。有时将 7 闪烁计数仪背景计数称为对照51C r 释放。 . 用裂解单位、图表或裂解值表述C T L 数据。将自发51C r 释放的范围或上限以裂解值百分比的标准误表示。内预激产生CTL前体体外用非M H C 编码抗原产生C T L 效应细胞的方法，来源于对该抗原体内应答扩抗原反应性T 细胞。虽然不同抗原所需的免疫途径和抗原剂量有所不同，但本方案本适用于大多数实验。

辅助方案 1 次要组织相容性抗原的小鼠体内应答

为在体内产生针对次要组织相容性抗原的应答，应采用与供者小鼠品系相同 H -2并且同性的小鼠作为受者。为产生抗 H -Y 反应（次要抗原的一个特例），采用雌性受者和同品系雄性小鼠的皮肤或细胞。

向受者小鼠移植皮肤或腹腔注射 IX IO⁷〜5 X IO⁷ 个脾脏细胞（在 0. 1〜0. 5 ml 体积内；附录 2E ) ，与单元 1 .2 中的方法制备的弗氏完全佐剂形成乳浊液。用无血清培养基
稀释细胞注射小鼠。在某些品系之间，可能需要在 10〜Md 后再次注射 IO⁷ 个脾脏细胞以产生强烈的体外再次应答。在通过适当途径进行体内免疫后，按诱导 C T L (见基本方案 1 ) 的方法制备脾脏单细胞悬液。对于再次应答，提供反应细胞的小鼠通常在最短1 周最长 1 年的时间内进行过体内免疫。

辅助方案 2 病毒抗原体内免疫小鼠

将流感病毒尿囊储存液用 1.0 ml P B S 稀释至 300 血凝素单位（H A U )。按附录 2E的方法进行腹腔注射。采用适当的途径进行体内免疫后，收集细胞，按诱导 C T L (见基本方案 1 ) 的方法制备脾脏单细胞悬液。

抗原修饰刺激细胞和靶细胞

在 51C r 释放实验中最好用活化细胞作为靶细胞，而正常脾脏细胞可用来刺激产生C T L (这样可以避免耗时的活化步骤。）

辅助方案 3 T N P 修饰靶/刺激细胞

材料

V H a n k s 平衡盐溶液（H B S S ) ，无蛋白质 T N B S 溶液 1 0 % 热灭活（56°C lh) F B S 以 P B S 稀释（P B S 见附录 1)，冰冷的 1 . 在 15m l 圆锥管中，用 14m l 无蛋白质的 H B S S 洗涤 <108 个靶细胞或正常脾脏细胞一遍，室温， 200g 离心 5min。弃上清。 2 . 用 0.1〜0.5ml H B S S 在 15m l 圆锥管中混悬细胞。加入 0.5〜0.1ml T N B S 溶液，轻轻混勻，盖上管盖置37°C 水浴 10〜15min。水浴过程中轻摇细胞1 或 2 次。 3 . 将 T N P 修饰的细胞用15m l 冷的等渗P B S 稀释的 1 0 % F B S 洗 3 遍（第 1 遍洗液是黄色的，第 2 遍、第 3 遍变得清澈）以结合未反应的半抗原（按步骤 1 进行）。 4 . 进行产生C T L 的操作或51C r 标记（见基本方案1 和 2)。

辅助方案 4 病毒感染靶/刺激细胞

材料（其他材料见基本方案 2 )

病毒易感的靶细胞（如有丝分裂原活化的T 淋巴母细胞对流感病毒易感）每毫升 1000〜3000血凝素单位（H A U ) 流感病毒的尿囊液（一70°C 保存） V RPMI- 1 0完全培养基警告：虽然该病毒主要适于在鸡胚中生存，但操作活病毒时仍须遵守标准的安全规范。 1 . 采用病毒易感的靶细胞，如有丝分裂原活化的T 淋巴母细胞对流感病毒易感（见基本方案 2 , 步骤 1)。 2 . 将含 100H A U 的流感病毒尿囊储存液用RPMI-10完全培养基稀释至0 •5ml。 3a. 51C r 释放实验：标记步骤开始时将〇 .5m l 病毒稀释液加到IO7 个靶细胞的细胞团块上（见基本方案2 , 步骤 6)，混悬细胞，加入 0.2ml 51C r 储存液。按基本方案 2 操作（在51C r 标记前进行感染或标记后孵育4h 可提高敏感性）。 3b. 产生对病毒修饰的同系细胞的反应：加入一份体积病毒（200H A U /ml) 至一份体积的 2 X 107 个刺激细胞/ml (均用致敏培养基稀释），按51C r 释放实验的步骤1〜5 进行操作（见基本方案2)。

不考虑抗原特异性的总 C T L 活性评价

下面的方案通过釆用有丝分裂原刺激 C T L 前体的方法绕过 M H C 限制性和 C T L 前体的抗原特异性。

备选方案 1 多克隆 C T L 活性的诱导

在 2 4 孔微滴定板中用含有恥 2ug/ml C o n A 的致敏培养基培养反应脾脏细胞

来源：丁香实验

细 胞 毒 性 T 淋 巴 细 胞 的 诱 导 及 检 测

基 本 方 案 1 从 C TL 前体中诱导细胞毒性

材 料

基本方案 2 络释放法分析 CTL 活性

材 料

辅 助 方 案 1 次要组织相容性抗原的小鼠体内应答

辅 助 方 案 2 病毒抗原体内免疫小鼠

抗 原 修 饰 刺 激 细 胞 和 靶 细 胞