B 细 胞 功 能 的 增 殖 检 测 方 法

基 本 方 案 抗 I g M 与 L P S 刺激的 B 细胞增殖

材 料（带 V 项 目 见 附 录 1)

纯化的静息 B 细 胞（单 元 2. 5)，采 用 Percoll 梯度离心制备

V D M E M -10 完全培养基

山羊抗 IgM (JacksonImmunoresearch) 或细菌 LPS (E . Difco #011B 4)

0.lm C i/m l 溶 于 HBSS ( 附 录 1 ) 的 [³ H ] 胸 腺 嘧 啶（20Ci/mmol/L ; Du PontN EN )

15m l 聚 丙 燦 管（Falcon)

9 6 孔 平 底 微 孔 板（Costar)

直接收集细胞到玻璃纤维板条的收集系统（P H D Harvester， Cambridge Technologies)

备 选 方 案 1 用 8-巯 基 喹 啉（8-MG) 剌 激 B 细胞多克隆活化

附 加 材 料（见基本方案）

8- M G (Sigma)

0.Imol/L N a O H

2mol/L HCl

1.如 果 8-M G 被作为唯一的 B 细胞激活剂，则采用位于 5 0 % 与 6 0 % Percoll 间纯化的 B细胞，而非位于 7 0 % Percoll 区带的静息 B 细 胞（单 元 2.5)。

2.准备 2 mmol/L 8- M G 液 体 ：将 5m g 8- M G (Sigma) 溶解于 0.3 ml 0 •lmol/L N a O H ，加 入 7. O m l 含添加物的 D M E M -I O 并 用 2mol/L HCl (15M1 ) 调 节 p H 至 7. 0 。

3.按基本方案步骤 3 单 独 将 0. 05 ml 2 mmol/L 8-M G 或 将 其 与 抗 Ig (0.5 mmol/L 终浓度）联合加入到 9 6 孔培养板中，每孔最终体积为 0. 2m l 。

4 . 继续基本方案步骤 4〜9。

备 选 方 案 2 用 蛋 白 激 酶 C 激活剂及钙离子载体刺激 B 细胞多克隆活化

附 加 材 料（见基本方案)

lmmol/L 溶于乙醇的 P M A 与 P D B U (Sigma)

10 mmol/L 溶于乙醇的 indolactam (LC Services)

lmmol/L 溶于乙醇的伊屋霉素（Calbiochem)

1 .采用含添加物的 D M E M -I O 准 备 P K C 激活剂与钙离子载体的工作液（每种设置三个稀释浓度）：

0.04〜4. Opmol/L P M A 与 P D B U

0.04〜4. Ojumol/L indolactam

0.4〜4. Ommol/L 伊屋霉素

2.按基本方案步骤 3 将 50M1 P K C 激 活 剂 与 5 〇 4 伊 屋 霉 素 按 每 一 稀 释 浓 度（来自步骤1 ) 加 入 到 9 6 孔 培 养 板（培养孔中终浓度为： P M A 与 P D B U ， 0.01〜1.0 Mmol/L ;
indolactam， 0.01 〜1.0jtxmol/L ; 伊屋霉素， 0.1 〜I.Ommol/L )

3.继续基本方案步骤 4〜9。

备 选 方 案 3 硫 酸 葡 聚 糖 与 poly (I : C) 刺 激 B 细胞多克隆活化

附 加 材 料（见基本方案）

备 选 方 案 4 细胞数量增加的定量

附 加 材 料（其他材料见基本方案，带 n/ 项 目 见 附 录 1)

V 磷 酸 缓 冲 盐（P B S )

用 P B S 制 备 的 0.5mol/L E D T A (冰冷的）

冰 冷 的 9 5 % 乙醇

lmmol/L Hoechst 33342 (Sigma)

lmmol/L 派洛宁 Y (Sigma)

5m l 圆 底 离 心 管（Falcon)

双 激 光 流式细胞仪（如 FACScan、 Becton Dickinson; 单 元 4. 2)