免疫球蛋白 G (IgG) 片段的水解

相关实验：免疫球蛋白 G (IgG) 片段的水解

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

步骤

木瓜蛋白酶水解 IgG 成 Fab 片段摸索性试验

此法适用于小鼠（任何亚类）、大鼠、人、山羊、绵羊、马、鸡、豚鼠和牛的 IgG水解。

材料

保存于 PBS (附录 1 ) 中的 2 mg/ml 纯化的 IgG (单元 1.5)

木瓜蛋白酶（2 X 结晶悬液； Sigma)

水解缓冲液：0.02mol/LEDTA (二钠盐）/0.02mol/L 半胱氨酸/PBS (新鲜配制，冰上保存< l0h)

溶于 PBS 的 0.3mol/L 碘乙酰胺（从结晶体新鲜配制； Sigma)

PBS

自制的微量透析槽或微量透析盒（如 Slide-A-Iyzer 透析盒； Pierce)

1.将 IOOud 2 mg/m l 纯化的 IgG 加入标有 1〜2 4 的 24 个微量离心管中。充分混匀木瓜蛋白酶悬液，不能振荡。准备两种浓度木瓜蛋白酶，溶于 5m l 水解缓冲液中，浓度分别是 0.lmg/ml 和 0 .02 mg/ml。

2.将 100ul 0.1 mg/ml 木瓜蛋白酶液分别加入 8 个 IgG 离心管中（酶/抗体比例为 1 : 2 0 ) ，将 IOOmI 0. 02 mg/ml 木瓜蛋白酶液分别加入第二组 8 个 IgG 离心管中（酶/抗体比例为 1 : 1 0 0 ) ，最后，将 IOOmI 不含木瓜蛋白酶的水解缓冲液加入剩余的 8 个 IgG 离心管中（对照组），所有离心管盖上盖子。

3.将所有离心管置于 37°C 水浴，在不同时间取出一组离心管，制作水解时间曲线图。一组离心管指一个 E/A 比为 1 : 2 0 的水解管，一个 E/A 比为 1:100 的水解管和一个对照水解管。水浴 Ih 时取出第一组离心管，接着在第 2 h、 4 h、 6 h、 12 h、 18 h、 24 h 和48 h 分别取出第二至第八组离心管。取出一组离心管后每管加入 20M1 0. 3mol/L 碘乙酰胺中止水解。

4.用自制的微量透析槽或商品化的微量透析盒将水解混合物对 PBS 透析。

5.用 150 mmXl.5 mm 1 0 % 非还原 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（单元 12. 3 ) 分析水解产物，上样量为 80M 1。当凝胶上在 150kDa (表示未水解的抗体）和 120kDa (表示仅半胱氨酸起作用）处没有显示蛋白质条带时，酶切反应完全。选择水解 IgG 获取Fab 片段的最佳试验条件，按基本方案 2 进行试验。Fab 片段大小为 5 〇 kDa 左右， Fc 片段大小为 27kDa，在 24kDa 和 15kDa 处的细条带是一些不重要的水解产物。

木瓜蛋白酶水解 IgG 获取 Fab 片段的大量制备

用摸索性试验的方法确定获取 Fab 片段的最佳试验条件（见基本方案 1)。

材料（带 V 项目见附录 1)

木瓜蛋白酶（2 X 重结晶悬液； Sigma)

水解缓冲液：0.02mol/LEDTA (二钠盐）/0.02mol/L 半胱氨酸/PBS (新鲜配制，冰上保存< l0h)

溶于 PBS (附录1 ) 中浓度> lmg/m l的 IgG (总量> 5 mg，单元 1. 5)

碘乙酰胺结晶

P B S ， p H 8. O

蛋白 A 交联琼脂糖凝胶 CL-4B

聚丙婦酰胺葡聚糖 S-200 Superfine (Pharmacia Biotech)

V 硼酸盐缓冲液，可选

1 0 % (m/V) NaN3，可选

5 mmX IOOmm 层析柱（Bio-Rad)

26 mmX 900 mm 层析柱 (Pharmacia Biotech)

1.混匀木瓜蛋白酶悬液，避免振荡。加入与待水解抗体相等体积的水解缓冲液溶解木瓜蛋白酶，选择从摸索性试验中已确定的最佳酶量、抗体浓度和孵育时间进行实验。

2.将木瓜蛋白酶液加入浓度为溶于 PBS 的 IgG 中，混匀， 37°C 水浴至所需时间（从基本方案 1 中确定）。加入结晶碘乙酰胺至终浓度0.03mol/L 中止水解反应，小心混勻，确保碘乙酰胺完全溶解。

3.将反应液转至透析袋中（CPI 附录 3 H) ，在 4°C 下对 2LPBSpH8.0 透析 12〜20 h。

4.准备 5 mmX100 mm 蛋白 A 交联琼脂糖凝胶 CL-4B 层析柱（单元 1.5、 CPI 附录 31)，将透析液上样。收集含有 Fab 片段和酶的未结合流穿液。如有需要，用 PBS 充分洗柱，收集所有 Fab 片段。

5.将含有 Fab 片段的流穿液浓缩至≤5 ml (CPI 附录 3 H)。

6.将浓缩液上样至 26 mmX 900 mm聚丙烯酰胺葡聚糖 S-200 Superfine 层析柱，收集分子质量大小为50kDa 的组分，用 SDS-PAGE 法鉴定分子质量大小或使用预平衡的凝胶过滤层析柱。

7.将 1〜80M 1终产物用1 0 % 非还原 SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳鉴定终产物的纯度。通过测定A₂₈₀值，确定 Fab片段浓度（表 1.5.1)。将 Fab片段保存在硼酸缓冲液中，于 4°C 保存；或者保存在含0• 02%NaN3 的 PBS 中，于一 70°C保存。

胃蛋白酶水解 IgG 成 F (ab’)₂片段的摸索性试验

在此试验中摸索在两个不同pH 下 IgG的水解情况，因为 IgG在低 pH 下会水解成 Fab片段或更小的片段。胃蛋白酶的水解比木瓜蛋白酶更剧烈，因此推荐的酶/抗体 (E/A) 比例以不超过1 : 2 0 为佳。注意：从 IgG2b 水解不能得到F (al/)2 片段，用胃蛋白酶水解IgG2b会得到相同分子质量的片段（120kDa) ，但这些是 Fab/c 片段（含一个 Fab片段和完整的Fc部分，图 1. 6. 1)。材料（带八项目见附录1) 3mg/ml纯化的IgG (单元1. 5) pH4.0和 pH5.0乙酸缓冲液： 0. 2m ol/L乙酸钠，用冰醋酸调至所需pH 0.1mg/ml胃蛋白酶（Sigma) : 溶于 pH4 . 0 乙酸缓冲液 O .lm g/m l胃蛋白酶（Sigma) : 溶于 pH4 . 5 乙酸缓冲液 2mol/L Tris 碱 VPBS 1•将2ml 3mg/ml纯化的IgG分别对着200m l乙酸缓冲液（pH 分别为 4. O和 4. 5 ) 透析， 4°C透析 4h (CPI附录 3H)。 2 . 用对应p H 的乙酸缓冲液作为空白对照测A28。值，确定两种透析后IgG的浓度（表 1. 5. 1)，用对应 p H 的乙酸缓冲液将两种IgG水解液的浓度调至2mg/ml。 3 . 将 100/xl 2mg/ml IgG pH4. O加入 1 6 个标号的微量离心管中，将 IOOjul 2mg/ml IgG PH4. 5 加入另外 1 6 个标号的微量离心管中。 4•将IOOmI 0 •lm g/m l胃蛋白酶液pH4. 0 加入 8 个 IgG pH4. 0 离心管中，将 IOOjLtl乙酸缓冲液pH4. 0 加入另外 8 个 IgG pH4. 0 离心管中。将 IOOiLtl 0 •lm g/m l胃蛋白酶

液 pH4. 5 加入 8 个 IgG pH4. 5 离心管中，将 IOOmI 乙酸缓冲液PH4. 5 加入另外8 个 IgG pH4. 5 离心管中[在两种不同pH 溶液中酶/抗体（E/A) 比例为 1 : 20]。 5 . 将所有离心管置于37°C水浴，分别在 lh、 2h、 4h、 6h、 12h、 24h 和 48h 时从四组各 8 个离心管中取出I 个离心管，在取出的离心管中加入40M1 2mol/L Tris碱终止酶解反应。 6 . 将水解液转至透析袋中，并准备微量透析槽，在 4°C下对着 IL PBS透析 4h。 7 . 用 1 0 % 非还原 SDS-聚丙烯酰胺凝胶（单元 1 2 . 3 ) 进行电泳分析，每管上样量为 8〇 W， F (ab')2 片段分子大小为IlOkDa, 较小分子质量（约 50kDa) 的条带可能是 Fab'片段。从中确定获取最大量F &1/)2 片段的最佳条件，用于基本方案4 中。

胃蛋白酶水解IgG 获取 F (al/)2 片段的大量制备

6 . 将流出液浓缩至< 5 ml ( C P I 附录 3H )。 7 . 将浓缩液上样至26m m X 900m m 聚丙烯酰胺葡聚糖S-200 Superfine层析柱上，用紫外检测器或分光光度计检测洗脱下的蛋白质峰。用 SDS-PAGE法或者预平衡的凝胶层析柱确定片段成分，收集分子质量大小为IlOkDa的组分。 8 . 鉴定终产物的纯度，用 10% S D S 还原和非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳，上样量为 1〜 20W 。在非还原凝胶电泳上， F (ab% 片段在 I l O k D a 处显示一条带，在还原凝胶电泳上， F (ab')2 片段在25k D a 处显示为单一条带或为二聚体。 9 . 测 A 28。值，确定 F (&1/)2 片段浓度。在硼酸缓冲液中的F “ 1/)2 片段可在4°C 保存，在含 1 0 % (m /V ) N a N 3 的 P B S 中的 F (ab7)2 片段可在一70°C 保存

备选方案用预先活化的木瓜蛋白酶水解IgG 制备 F (ab)2

此法可酶解Ig G1 成 F (ab)2 片段。另外，从小鼠 ^ & 和 IgG2b获取 F a b 片段也可以用此方案。这是一种更温和且更稳定的酶解方案，可获得更多的酶解片段。附加材料（其他材料见基本方案4 ，带V 项目见附录 1) 溶于 2〜5ml P B S 中的 I O m g IgG (单元1. 5) V 乙酸/ E D T A 缓冲液， p H 5. 5 2m g / m l 木瓜蛋白酶溶于乙酸/ E D T A 缓冲液中 0,05m o l / L 半胱氨酸（无碱，结晶； Sigma) 碘乙酰胺结晶 P D -10 层析柱（Pharmacia Biotech) 1 . 将溶于 2〜5ml PBS中的 IOmg IgG用乙酸/EDTA缓冲液透析（CPI附录 3H )，用乙酸/EDTA缓冲液作空白对照，测 A28q值确定 IgG浓度。 2 . 将 2m g / m l 木瓜蛋白酶液和0. 05m o l / L 半胱氨酸置于37°C水浴 30m i n 。 3 . 用 20m l 乙酸/ E D T A 缓冲液平衡P D -10层析柱（CPI附录 31)，将木瓜蛋白酶/半胱氨酸上样，用乙酸/ E D T A 缓冲液洗脱，收集 1 0 个 I m l 组分。 4 . 测定组分义28()值，将 2 或 3 个包含木瓜蛋白酶的组分合并。按下列公式计算预活化的木瓜蛋白酶浓度。 A28〇 /2. 5= mg预活化的木瓜蛋白酶/ml 将预活化的木瓜蛋白酶置于冰上保存，并在 2h 内使用。 5 . 在透析好的I O m g I g G 溶液中加入0.5m g 预活化的木瓜蛋白酶，振荡混匀，在 37°C 水浴中水解6〜12h ，加入碘乙酰胺结晶至终浓度0 •〇 3mol/L 中止反应。 6•在 4°C 用 I L P B S pH8. 0 透析 6〜12h 。 7 . 用 PBS (PH8 . 0 ) 平衡蛋白A 交联琼脂糖凝胶CL-4B 层析柱，上样，收集未结合的蛋白质，每组分 2ml，将出现在第一个峰的未结合组分合并（用紫外或分光光度计检测）。 8 . 将未结合组分浓缩至< 5 ml (CPI附录 3H )。 9 . 将浓缩液上样至凝胶过滤层析柱上，用紫外分光光度计监测组分的A28。值，收集 100 个组分（1 % 柱体积）。用 SDS-PAGE确定包含所需片段的组分（单元 12. 3)，或者

用预平衡的凝胶过滤层析柱确定。硼酸缓冲液中的F (&1))2 片段可在 4°C 保存，含 0. 0 2 % N a N 3 的 PBS中的F (ab)2 片段可在一70°C保存。参考文献： P a r h a m ， 1983 撰稿人： Sarah M . A n d r e w and Julie A . Titus

来源：丁香实验

免 疫 球 蛋 白 G (IgG) 片 段 的 水 解

木 瓜 蛋 白 酶 水 解 IgG 成 Fab 片段摸索性试验

材 料

木瓜 蛋白 酶 水解 IgG 获 取 Fab 片段的大量制备

材 料（带 V 项 目 见 附 录 1)

胃蛋白酶水解 IgG 成 F (ab’)2片段的摸索性试验

胃蛋白酶水解IgG 获 取 F (al/)2 片段的大量制备

备 选 方 案 用 预 先 活 化 的 木 瓜 蛋 白 酶 水 解IgG 制 备 F (ab)2