胚 胎 干 细 胞 体 外 培 养 与 定 向 诱 导 分 化

胚胎干细胞分离培养

饲 养 细 胞 培 养 与 饲 养 层 制 备

饲养细胞是胚胎来源的干细胞包括胚胎癌细胞 (EC)、胚胎干细胞 (ES)、原始生殖细胞 (EG) 等细胞在体外保持对称分裂不分化状态的必要条件。其作用机制不完全清楚。对于小鼠胚胎干细胞，饲养细胞分泌的 LIF 是保持其多能性的原因之一，因此，在某些鼠细胞培养中，饲养细胞或 LIF 二者有一即可。对于人类胚胎干细胞培养，饲养细胞目前仍是必需的。通常用两类细胞作为胚胎干细胞培养的饲养细胞，即原代培养的胚胎鼠成纤维细胞 (MEF) 或小鼠成纤维细胞 STO 系 (来源于近交系 SIM 小鼠， thioguanine and ouabain-resistant)。经 y 射线照射或丝裂霉素 c 处理以抑制其有丝分裂活性，然后接种至明胶包被的培养皿，作为胚胎干细胞培养的饲养细胞。

胚 胎 鼠 成 纤 维 细 胞 的 分 离 与 培 养

MEF 可从任一品系的小鼠分离，需 从 1 或 2 只孕母鼠中取 1 〇个以上胚胎。

1) 试剂和材料

(1) 孕 13——14 天母鼠，见栓当天确定为孕 1 天。

(2) 无菌解剖器械： 眼 科 剪 2 把、 眼 科 镊 2 把、玻 璃 平 皿 3 对 、小 平 镊 1 把、组织剪 1 把。

(3) 无Ca ²⁺、Mg ²⁺的 PBS,0.05% 胰蛋白酶溶液/0.53mol/L EDTA， 1 0mg/ml Nase溶液。

(4)MEF 生长培养基：高糖型 DMEM，含 10% 胎牛血清。

(5) 35 mm、 60 mm 和 IOOmm 组织培养皿。

2 ) 分离方法

脱颈处死孕母鼠，打开腹腔，取出子宫，放在盛有 PBS 的玻璃培养皿中，用眼科剪沿子宫纵轴剪开子宫，取出胚胎，去除胎盘、羊膜等胚胎外组织， PBS 冲洗去歡血。用镊子去除胚胎头和内脏。 PBS 清洗 2 次 ，去除血及残余的内脏组织。用眼科剪剪碎残余胚胎，将糊状组织物转移至 20m l 的平底刻度试管，加 5 ml 胰蛋白酶溶液、 4OOul DNase粗品，以免释放出的 DNA 导致溶液过黏。 37℃水浴孵育 30 min，或 4℃ 放置过夜，振荡，然后将上层细胞悬液倒入一装有 IOml MEF 生长培养基的 IOml 离心管，混勻。 1000r/min离 心 6 min 收集细胞。再将细胞悬于 15 ml 生长培养基中，用血细胞计数板计数细胞。 10只 15 天胎鼠可获得 5xl 〇 7〜 IxlO ⁸ 个细胞。每 IxlO ⁶ 个细胞悬浮于 10 mlMEF 生长培养基，接种至一个 IOOmm 培养皿。细胞接种后立即贴壁， 24 h 后更换新鲜 MEF 生长培养基。约 2——4 天后细胞长满，吸除培养液，加 入 PBS 清洗 2 次 ，每皿加入 6——7 ml 胰酶，室温孵育 3——5 min。在胰酶消化的每个细胞皿中加 10 m ! 生长培养基，轻柔吹吸，使细胞分散再 将 悬 液 转 移 到 50m l 离心管，两块皿的细胞合并到一管中。离心收集细胞，细胞悬于培养液中， 1 : 3 分 加 到 3 个 I O O m m 培养皿中。约 3 天后细胞长满，可以收集细胞冻存于液氮中。

3) M E F 的质量

用上述方法分离的原代胚胎鼠成纤维细胞不纯，主要成分是成纤维样细胞，但还有神经样细胞、心肌细胞以及一些类型不清楚的细胞。传代后杂细胞减少，随传代数增加，细胞成分趋于单一，但细胞的增殖能力降低， 3——5 代后细胞基本停止增殖。实验中所用的饲养细胞传 3 代以内为佳。不过，细胞的增殖能力是相对的，与培养液关系较大，尤其血清的质量对其影响很大。另外，用于分离的胚胎鼠的胎龄也影响所分离细胞的质量与纯度。大 于 16 天龄的细胞成分很杂，通 常 13〜 14 天龄较好。

冻 存 与 复 苏

1 ) 冻存
(1)M E F 冻存培养基：高糖 型 D M E M ，含 10% 血清、 10% D M S O , 用前新鲜配制。

(2)1.8 mI 冻存管、 1.2m l 冻存管。

(3) 8 0 % 〜 9 0 % 汇合的细胞，吸除培养液/ P B S 洗 1 次 ，每 个 I O O m m 皿中加入 0.05%胰 酶 6〜 7m l ，室温下孵育 3——5 min，每 皿 加 入 IOmI 含 10% 血清的培养液以中止胰酶的消化作用 。然后将细胞悬液转移至 50m l 离心管， 1000r/m i n 离 心 5 min; 细胞沉淀用冻存液悬 浮 ，每 个 I O O m m 皿 的 细 胞 加 人 代 预 冷 的 冻 存 液 lml。

(4) 每只冷冻管加 Imi 细胞悬液，旋紧盖子， 4¾ 平 衡 30 min， -2 0℃ 放 60〜 90 min，液氮蒸气 (约- 7 0℃) 中 放 2 h ，然后转移到液氮中长期保存。

2 ) 复苏

IOOOml 烧杯一个，高压灭菌蒸馏水 5 〇〇 mI。将灭菌蒸馏水水浴加温至 37——40℃ ，倒入烧杯中；从液氮中取出细胞冻存管，立即侵人温水中并快速搅动直至冰晶融化。将融化的细胞悬液转移至装有等体积培养液的锥形离心管中， lOOOr/m i n 离 心 5 min，细胞沉淀用培养液悬浮，每支冻存管的细胞接种至一个 I O O m m 培养皿。细 胞 在 30——60m i n 后即
贴壁。第二天更换培养液，去除死亡细胞。 2——3 天 可 传 代 ，或制备饲养细胞。

饲 养 细 胞 制 备

融化冻存的 M E F 细胞，为避免其增殖超过 E S 细胞，要使其停止有丝分裂，然后在适 于 E S 细胞生长的培养皿中接种。本文采用两种方法抑制 M E F 细胞的有丝分裂，即 Y射线照射或加入丝裂霉素 C (l0ng/ml) 培 养 2.5——3 h 。

丝裂霉素 C 处理

1 ) 试剂及材料

(1) l0 ug/m l 丝裂霉素 C 溶 液 ： 2m g 丝裂霉素 C 粉 剂 加 入 IOml P B S 溶 解 ，过滤除菌，每管 分 装 0.5m I ， -20℃丈避光冻存。用 前 每 0.5m l 加 入 9.5 ml D M E M 液 ， D M E M 浓度为
10ug/ml。锡箔纸包裹避光， 4 ℃可 保 存 2 周 。

(2) 0.1% 明胶溶液：将 5 g 明 胶 加 入 至 500m l 注射用水中，高 压 灭 菌 , 浓 度 为 1 % ，4℃保 存 。使用时取 1 〇 ml，加入 9 〇 mlPBS，浓 度 为 0.1%， 4 ℃保存。

(3)35 cm、 60 cm、 IOOcm 等各种型号的组织培养皿。

2 ) 操作方法

长 至 80%——90% 汇 合 的 细 胞 ，吸 除 培 养 液 ，加 入 丝 裂 霉 素 c 溶 液 (100 mm/6 ml、60 mm/2 ml、 35 mm/lml)， 3 7 ¾ 孵 育 2〜 3 h ; 吸除丝裂霉素 C 液 ，加 人 6 ml PBS 洗 2 次 ，
去除残留的丝裂霉素。加 入 6m l 胰 酶 ，室温下鮮育 3〜5 min，加入等体积的含血清培养^以中止消化；细 胞 悬 液 1000r/m in 离 心 5 min; 沉淀用培养液悬浮，计 数 ，按 I05 个/cm2细胞密度接种到 0.1% 明胶包被 (加入明胶溶液，室温下放置 30 min) 的 培 皿 。饲养细胞
的 接 种 密 度 以 50%——60% 汇 合 为 宜 ，如 图 3.1 所示。

射线照射

将培养在皿中的细胞用相对干净 (无菌最好) 的盛器如铝盒、搪瓷盒等送至钴源室，照射剂量 25——35 Gy，即可灭活细胞的有丝分裂活性，而细胞仍然可以存活—定时间。照射后按上述同样的方法消化、接种至明胶包被的培养皿即可。若钴源设备便利，如离实验室近，可随时使用， Y 射线照射的方法简单、效率高。我们通常分离一次，培养出大量细胞，一起照射，然后冻存。使用时，解冻并直接接种至明胶包被的培养皿，第 2 天更换培养液后即可用于胚胎干细胞的培养。

照射剂量须灵活掌握，根据我们的经验，增殖旺盛的细胞照射剂量要大，如原代细胞照射剂量不可小于 30 Gy; 传 代 3——5 代 的 细 胞 ，照射剂量以 20 G y 为宜，剂量太大， 3天后细胞就大量死亡。

3.1.2 小鼠胚胎干细胞的分离培养

胚胎干细胞来源于囊胚内细胞团 (inner cell mass, ICM)，可长期增殖、具有多项分化潜能。自 1981 年小鼠胚胎干细胞培养成功以来, 大量研究发现胚胎干细胞能无限增殖、保持正常核型、在体内及离体条件下可分化为机体内所有的组织细胞类型，包括有功能的生殖细胞。小鼠胚胎干细胞是转基因、胚胎发育、细胞分化等研究的重要模型。胚胎干细胞培养的难点在于培养系统不仅要满足细胞增殖的需要，同时在长期培养的过程中要保持细胞不分化。本文首先介绍小鼠胚胎干细胞的分离培养。

内 细 胞 团 的 分 离 与 培 养

内细胞团的分离方法有两种：显微分离法与免疫外科法。显微分离法是在显微镜直视下机械性地分离出内细胞团。免疫外科法的原理是：大分子如免疫球蛋白不能通过囊胚滋养外胚层进入囊胚腔，因此利用免疫介导的细胞毒作用，可选择性地破坏滋养外胚层细胞，而囊胚腔内的细胞-内细胞团则不受影响。本文将介绍用免疫方法分离内细胞团。

1 ) 材料与试剂

(1) 兔抗鼠血清：室温融解， 56T 水 浴 30m i n 以灭活补体，过滤除菌， -20℃保存。

(2)豚 鼠 血 清 ：成年豚鼠 (北医动物中心)1 只，抽心脏血约 5m l ，缓慢注入锥形离心管 内 ， 2000r/m i n 离 心 15 min，吸出上层血清，过滤除菌， 0.2 ml/管分装， - 2 0 ℃保存。

(3) 0.5% 链霉蛋白酶： I O m g 融 于 2m l 生理盐水过滤除菌，0.2 ml/管分装， -20℃保存。

（4） E S 细胞培养液：高 糖 D M E M 培养基，其 中 含 20 % F C S 、 1 % 非必需氨基酸、O.lmmol/L 巯基乙醇、2 mmol/L 谷氨酰胺、50U/ml 青霉素、50U/ml 链霉素、 1000U/ml LIF。

(5) 129Sv(129/SvpaslcoCrIBR) 孕鼠。

2 ) 操作方法

分离的过程均在石蜡油覆盖的 3 0 0 液滴中进行；孵育的条件为 3 7 ℃、 5% CO2; 抗体和豚鼠血清均用 DM EM 培养液稀释。

将 见 栓 3.5 天 的 129S V 孕鼠脱颈处死，剖开腹部，取下子宫角。用 3 7 ¾ 预热的含血清培养液冲出胚胎。 0.5% 链霉蛋白酶消化约 5m i n 以去除透明带。将去除透明带后的胚胎移入 含 10% F C S 的 D M E M 培养液中培养 3 h。用免疫溶解法 (immunosurgery) 去除外滋养细胞，
过程如下：将胚胎移入 I : 10 稀释的抗鼠血清液滴中孵育 30 min; D M E M 液滴洗 3〜 5 次 ，每 次 5 min; 再 在 I : 10 稀释的豚鼠血清液滴中孵育 I5——30 min; D M E M 液滴清洗；然后用尖端直径为 30〜 4 〇um 的细吸管轻轻吹打，分出内细胞团，接种到饲养细胞上，37℃, 5%C 0 2、 9 5 % 湿度条件下培养，每天更换培养液。培养液为前述 E S 细胞培养液。

3 ) 结果

7 个小鼠囊胚 (图 3.2) 为脱透明带后囊胚，在抗血清中孵育后，移入补体孵育约 5 min，外滋养细胞肿胀 (图 3.3)，继 续 孵 育 10〜 25m in 后 ，用细吸管轻轻吹打，可分离出完整的内细胞团 (图 3_4)。内细胞团接种后 24 h 内贴壁，其 中 4 个 长 出 E S 样细胞，细胞呈集落
状 ，边缘清楚，细胞核大、核仁明显、核浆比高 (图 3.5 和 图 3.6)

 

E S 样 细 胞 扩 增

内细胞团接种后 24 h 内贴壁， 3——5 天可见到具有典型的大核且核仁明显的小细胞长出 ，将出现此种细胞的细胞团用细玻 璃 吸 管 取 下 ， 0.01% 胰 酶 消 化2 min，细吸管吹打，将打散的单细 胞 和 小 细 胞 团 接 种 到 新 伺 养 细 胞上 ，每天更换培养液，培养液同上述内细胞团培养液。 3——4 天 后 可 见到典型的干细胞集落， 5——6 天 后 集
落长大至直径 100〜 200p m 。将典型集落用机械法取下， 0.05% 胰酶消化 ，打散成单细胞，接种至新饲养细胞上，每天更换培养液， 2 天后可见到多个干细胞集落。编号 为 A 与 G 的 2 个扩增顺利 ，建立了 2 个细胞系，核型均为 40 XY(图 3.7)。 A 系细胞在传代、冻融过程中很易分化 ，传 至 15 代冻存。 G 细胞系在传代冻融过程中稳定，第 11 代行单细胞克隆，故单细胞克隆细胞系名为 G11q 每 3〜 4 天用胰酶传代并冻存部分细胞。冻 存 液 含 90% 干细胞培养液、 10%DMSO。

 

单 细 胞 克 隆

核型正常的细胞用胰酶消化以打散成单细胞，接 种 到 3 5 mm 皿 ，培养箱中 Ih ，换 液 ，将贴壁的细胞轻轻吹下，移入另一个皿中，在解剖镜直视下用吸管将单个细胞移入铺有饲 养 细 胞 的 9 6 孔板。隔天更换培养液，约 5〜 7 天后出现明显集落。胰酶消化打散成单细 胞 ，接 种 到 35 mm 皿 ，每天更换培养液。每 3 天传代并冻存部分细胞。结果：共接种192 个 孔 ，生 长 出 6 4 个单细胞集落，克 隆 率 为 33% 。其 中 5 个核型不正常。挑选出核型正常的集落扩增，一旦扩增正常，细胞系即建立。

鉴 定

1 ) 材 料 与 试 剂
(1) 秋 水 仙 素 (Sigma,C9754) : 用 水 配 成 5ug/ml 的质量浓度，4℃ 保 存 ，使用时稀释至 250ng/mI

(2) 低 渗 液 ：〇. 〇 75mol/L 氯化钾溶液，置 37℃温箱。

(3) 固 定 液 ：甲 醇 ：乙 酸 =3 : 1，使用时新鲜配制。

(4) 消 化 液 ： 0.2% 胰 酶 ，使用时新鲜配制。

(5) Gimsa 染液。

(6) 抗 体 ：大鼠抗 SSEA-l(MC-480)、 SSEA-3(MC-631)、 SSEA-4(MC-813-70); 鼠抗TRA-1-60(MAB4360). TRA-1-81(MAB4381), OCT-4(MAB4305)

(7) FITC 标记山羊抗大鼠 IgG(ZF-0312)。

(8) 碱性磷酸酶缓冲液： 100 mmol/L N a C l 、 5 mmol/L MgCl2、 lOOmmol/LTris .HCKpH9.5)。

(9) 碱性磷酸酶显色底物： NBT/BCIP(SK-5400)。

2) 表面标志及核型鉴定方法及结果

(1) 核型鉴定：采 用 常 规 G 带法。增殖指数期的细胞 (传 代 后 3 天)，更换新鲜培养液 ，加入秋水仙素，放 回 培 养 箱 培 养 2 h ; 吸出含秋水仙素的培养液，加 人 0.05% 胰酶 /0.53 mm 〇 l/LEDTA，室温下消化 3——5 min，然后加入等 体 积含血清培养液以终止消化，巴斯德吸管吹打，将 细 胞 悬 液 l 〇〇〇 r/min 离 心 6 min， 去上清，向沉淀加入 4m l 低渗液，吸管吹打混匀，37℃水 浴 8 min; 加 入 固 定 液 lm l，轻轻吹打混勻；1500r/min 离 心 IOmin,弃 上 清 ，沉 淀 加 入 4m l 固定液，轻轻吹打混匀；离 心 ，重 复 固 定 1 次 ；弃 上 清 ，沉淀加 入 0.5——lm l 固定液悬浮；将细胞悬液滴至浸在〇丈蒸馏水中的干净玻片上；晾干6 5 ℃烤 片 2〜 4 h; 玻片放入消化液中消化 8——10s， 加生理盐水终止消化； Gimsa 染液中染 色 2—— 4m in ; 自来水冲洗终止染色；晾干，显微镜下观察， Cytoktype5.0 软件进行核型分析。

⑵ 碱 性 磷 酸 酶 检 测 ：采用细胞化学法。在 35m m 皿中培养的细胞，用 P B S 洗 1 遍 ，4 % 多聚甲醛室温下固定 30 min; P B S 洗 3 遍 ，每 次 5 min; 加 人 Iml 含 镁 Tris • H C l 缓冲液 (p H 9.5)，加 人 N B T /BCIP(VeCtor) 各 5Ial，混 勻 ，室温下避光孵育直至显色满意；自来水冲洗以终止反应。

⑶ SSEA-I 染 色 ：采用免疫组化二步法。鼠抗 MC-480(SSEA-1) 购自美国 Iowa 大学染 色 试 剂 盒 EliVision™购自福州迈新生物技术开发公司，按试剂盒提供的步骤进行操作 。培 养 在 4 孔板中的细胞用 4% 多聚甲醛固定，PBS 洗 3 次 ，每 次 5 min; 每孔加入 30003% 过氧化氢，室 温 下 孵 育 IOmin; PBS 清 洗 3 次 ；加 入 1 :200 稀 释 的 抗 SSEA-I， 4℃过 夜 ； PBS 清 洗 ，加 入 300jil 增强子聚合物，室温下孵育 30 min; PBS 洗 3 次 ，二氨基联苯(diaminobenzidine，DAB) 显 色 。

⑷ 结 果 ：有 正 常 的 40XY 核型。符合未分化小鼠胚胎干细胞的特征 (图 3. 7) 〇细胞的表面标志碱性磷酸酶、 SSEA-I 均为阳性 (图 3.8 和 图 3.9)。

3 ) 在体分化鉴定方法及结果

⑴ 鉴 定 方 法 ：约 IO7 个胚胎干细胞，悬 浮 于 0.1〜 〇.2m l P B S 液中，注 入 4 周龄的裸鼠皮下。 4——5 周 后 处 死 ，取出瘤块， 4 % 多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片， H E 染 色 ，显微镜下观察。

(2) 结 果 ：裸鼠皮下注入细胞后两周可触及包块，包块进行性增大。组织学对包块进行鉴定发现其中含有来自 3 个胚层的组织细胞：如来自鳞状上皮组织、神经组织、软骨 、柱状上皮等组织的细胞。证实所培养的细胞在体内条件下具有分化为 3 个胚层组织细胞的能力。

人 类 胚 胎 干 细 胞 的 分 离 培 养

人类胚胎干细胞的分离培养包括：内细胞团的分离、胚胎干细胞的识别、胚胎干细胞的扩增等内容。人类胚胎干细胞成功的分离培养，必须具备以下几个关键条件：①质量良好的囊胚；②有效的内细胞团分离；③ 可 靠 、稳定的培养系统；④可 靠 、有效的传代。

内 细 胞 团 的 分 离 、培 养

在小鼠胚胎干细胞的分离培养中，已经证实免疫外科方(immunosurgery)
是一种可靠、有效的内细胞团分离方法，故本小节采用此方法分离人囊胚内细胞团。

抗 血 清 、 补 体 制 备

1 ) 血清制备

采用人绒毛膜癌细胞株 J E G -3 细胞 (图 3.10) 对兔进 行 免 疫 ，制备抗人绒毛膜细胞的抗血清。方 法 如 下 ：日本大耳白雄兔一只，体 重 2 . 0k g 。 J E G -3 细 胞 约 107+ ，悬浮于 3 —— 5 ml P B S 中 ，将细胞从兔耳缘静脉注入。一 天 1 次 ，连 续 3 次 。末次注射后第1 5 天 耳 缘 静 脉 抽 血 2m l 、第 1 7 关 心 脏 抽 血 6m l 、第 2 0 天 心 脏 抽 血 12m l 后处死兔。血 样 室 温 下 放 置 30m i n 后 ， 2 5 0 0 r/m in 离 心 15 min，吸 取 血 清 ， 5 6℃ 水 浴 30 min，灭活补 体 ，过 滤 除 菌 ， 0.5 ml/管 分 装 ， - 2 0 ¾ 保 存 。

2 ) 补体制备

采用豚鼠血清作为补体。 3 月龄豚鼠 2 只 ，心脏抽血，每只豚鼠大约可抽 5〜 6ml 心脏血。血样室温下放置 30m in 后 2500r /m in 离 心 15m in ， 吸取血清，过滤除菌，0.5ml/管分装， -2 〇 ℃存 。

内 细 胞 团 分 离

1 ) 试剂
抗血清、补体同上所述。

0.5%pronaseE(Merck) : 用 G -2 配制， 0.5 ml/管分装， - 2 0 ℃ 保存。

2 ) 方法

抗血清 、补 体 均 用 D M E M 液稀释。抗 血 清 1 : 5 0 稀 释 ，补 体 1 : 1 〇稀释。反应均在石蜡油覆盖的 30ul 液滴中进行。 5——7 天 后 龄 囊 胚 移 入 0.5% pronaseE 液滴中，解剖镜下观察，大 约 3——5m i n 后透明带消失；将消除透明带的囊胚移入 D M E M 液滴中清
洗 ；再将囊胚移入抗血清液滴中孵育 30 min; 再 移 入 补 体 液 滴 中 孵 育 30 min; 外滋养细 胞 肿 胀 的 囊 胚 移 入 D M E M 液滴中清洗；然后用细吸管轻轻吹打，即可分出内细胞团 (图 3.11)。

3) 结果
一 共 有 3 0 个囊胚进行分离，其 中 第 1 个囊胚 (6A A 级) 因分离条件未成熟，分离时内细胞团与外滋养细胞全部被溶解，其余囊胚内细胞团在 B 级以上者均分出完整的内细胞团 共 15 个 。

内 细 胞 团 培 养

1 ) 培养液

Knockout ^TM培养基，含 2 0 % FBS ，加入 1% 非必需氨基酸、 0.1mmol/l巯基乙醇、 2m m ol/L 谷氨酰胺、 50U /m l 青霉素、 50U /m l 链霉素，此为含血清培养液；将 FBS换成相同浓度的血清代用品，加 入 4ng/m l b F G F ，此为无血清培养液。

2 ) 培养方法

分离内细胞团前一天制备词养细胞，接 种 到 0.1% 明胶包被的 4 孔 板 ，培养过夜。第2 天将分离出的内细胞团接种至 4 孔 板 ， 3 7 ℃ 、 6 % C 0 2、 9 4 % 湿度条件下培养。每天更换新鲜培养液。

3 ) 结果

接 种 的 15 个内细胞团 24 h 内全部贴壁，其 中 14 个 在 12 h 内贴壁，有 1 个 24 h 时才贴壁。说明分离出的内细胞团保存了完好的生物学活性。 1 4 个接种至新鲜制备的 M E F饲养细胞上， 5 个凋亡， 2 个仅有滋养细胞，另 7 个在增生的滋养细胞中心长出细胞界限不清的小细胞团 (图 3.12)，其 中 3 个第一代分化，另 4 个增殖旺盛，因此，从 14 个内细胞团培养出 4 个胚胎干细胞系，即 B ₄、 B ₇、 P K U ₁ P K U ₂。一个内细胞团接种在成人子宫内膜间质细胞饲养层， 4 天后凋亡。

E S 样 细 胞 扩 增

人类胚胎干细胞的传代比较困难，文献报道有机械法、胶原酶法、 Dispase 法 、 EDTA法等。集落少时，机械法传代比较有效、可靠。当集落有成百甚至几百个时，机械法几乎是不可用的。本节摸索了多种传代方法，建立了有效的 E S 细胞大量扩增方法。

1 ) 机 械 法

将细胞集落切成小块，每小块大约 200——300 个细胞不等。用吸管将细胞小团块接种到新饲养细胞上。细胞团与内细胞团一样在 12 h 内贴壁。机械法比较有效、可靠，细胞损失小。但不足之处在于费时、集落大小不一，往 往 4 天需传代。

2 ) 胶原酶法

这 种 方 法 是 文 献 中 使 用 最 多 的 人 类 胚 胎 干 细 胞 传 代 方 法 。用 lm g /m l 胶原酶(Collagenase)IV 消 化 细 胞 10——20 min，吹打，将细胞团悬液移入锥形离心管， 1000r/min离 心 6 min◦ 弃上清液，沉淀用培养液打散，吹打数下，将细胞团分散至一定大小，小于5 0 个细胞较好，然后按一定比例 (通 常 按 1 : 6) 接种至新饲养细胞上。胶原酶的作用较温和 ，细胞存活良好，但集落分散程度不够，传代后长出的集落大小不一。

3 ) 胰酶法

用 0.05% 胰酶/O_53 mmol/L E D T A 消 化 细 胞 3——5 min，镜下见细胞回缩、发亮，但未浮 起 ，吸出酶溶液，加入含血清培养液以终止消化作用，然后用巴斯德吸管吹打，将细胞悬液移入锥形离心管， l 〇〇〇 r/m in 离 心 6 min，弃上清液，沉淀用培养液打散，按一定比例接种至新饲养细胞上。胰酶消化后细胞集落分散成单细胞和包含有 3——5 个细胞的小团 ，传代后长出的集落大小均勻；不足之处是消化的时机较难掌握，胰酶对细胞损伤大，细胞易死亡。

4) Dispase 法

Dispase 是作用温和的酶类，常 用 lOmg/ml 质量浓度，消 化 细 胞 30 min, 细胞集落完整脱落，然后离心，弃上清液，沉淀用培养液悬浮后，再次离心，加人培养液，吹打，接种至新饲养细胞上。 -总之，人类胚胎干细胞的传代目前较公认的方法是机械法和胶原酶法，并认为以小
细胞团 (5 0 —— 1 0 0 个细胞) 传代最有效。有的细胞系自始至终均用机械法，如韩国干细胞中心的细胞系，这种方法最可靠，但最费力。另外胶原酶对细胞的损伤小，传代后细胞的活性良好，是可靠的传代方法。胰酶传代效率高，孵育时间短、细胞分散好，但作用太强 ，较难操作，细胞易死亡。本研究发现，单个细胞传代只要细胞活性良好，传代后不死 亡 ，细胞生长旺盛，集落均匀，能更好地保存细胞的不分化状态。本研究提及的 4 个
细 胞 系 在 3〜 5 代以内用机械法传，长 满 一 个 3 5 c m 皿后采用胶原酶或胰酶消化传代。 4个细胞系均增殖旺盛， B ₄ 传 3 〇代冻存、 B ₇ 传32 代 冻 存 、 P K U ₂ 1 9 代冻存。 P K U ₁连续传代、已 传 3 0 代 。

单 细 胞 克 隆 细 胞 系 的 建 立

在人类胚胎干细胞培养之初，认 为 hE S 在单细胞时很难存活，因此，克隆率很低，小 于 1 % 。本研究在培养传代过程中，发 现 h E S 分散成单细胞时的存活率与小团状时的没有明显差别，只是操作过程很难掌握，细胞在消化分散过程中易死亡。因此，如能提高消化后单个细胞的生物活性，就将提高克隆效率。

1 ) 方法

本研究使用处于生长指数期的 P K U ₁ 系细胞 (传 代 后 3 天)，吸出培养液， P B S 洗 2遍 ，加 入 0 . 0 5 % 胰酶/0.53m m o l / L E D T A 在 4T 消 化 5 min, 吸出胰酶，加入含血清培养
液终止胰酶的消化作用；用巴斯德吸管轻轻吹打，将细胞悬液移入到另一个明胶包被的无饲养细胞的 35c m 培养皿中，放回培养箱培养 20 min，活性良好的细胞将黏附至皿底；20m i n 后吸出培养液以及死亡的和未贴壁的细胞，加入新的无血清培养液，将黏附在皿底的细胞轻轻吹下，吸 出 5 0 0 细胞悬液，放入另一个装有 Iml 无血清培养液的 35c m 培养 皿 ，混 勻 ，放 置 5 min，使细胞沉降至皿底。用 尖 端 口 径 2 〇〜 3 〇 n m 的吸管将单个细胞接种至已有伺养细胞的 9 6 孔板 (coming)，每个细胞放入 1 个孔。每天更换培养液。第 7〜 8天后可见长出的单细胞克隆。第 12 天用胶原酶消化传代。

2 ) 结果
本研究中接种的 9 6 个细胞长出 2 个单细胞克隆，克隆率约 2 % ，较文献报道的克隆率高，部分证实了本研究的假设。但 是 ，与 小 鼠 3 3 % 的克隆效率相比，人类胚胎干细胞单细胞克隆率要低得多，说明在低密度状态其生长活性确实较低。

人 类 胚 胎 干 细 胞 鉴 定

人类胚胎干细胞的基本特征包括：来源于囊胚的内细胞团，无限的增殖能力，具有正常核型，在体内、离体条件下均能分化为三个胚层的组织细胞。另外，表达特异的表面 标 志 ，如碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase, AP)、胚胎阶段特异性抗原 (stagespecificembryonicantigen,SSEA)、肿瘤识别抗原 (tumor recognition antigen,TRA) 等。

生长形态

4 个细胞系的细胞呈集落状生长，集落形态与灵长类胚胎干细胞和人类胚胎癌细胞的集落形态相似，扁平状，细胞界限清楚；而小鼠胚胎干细胞呈堆积状，细胞界限不清。集落内的干细胞核大、核仁清楚，胞核与胞质的比率高 (图 3.13)。

核型

人类胚胎干细胞的基本特征是核型正常，长时间培养仍然保持正常核型。这是胚胎细胞与胚胎癌细胞最本质的区别。本研究在细胞传代 8——24 代中多次检测核型，发 现 4个细胞系核型正常且稳定。

⑴试剂同 3.1.2.4

⑵方法同 3.1.2.4

⑶ 结 果 ：4 个细胞系核型均正常，B 4 46 X X 、 B 7 46 X Y 、 P K U 146 X X 、 P K U 246 X Y 。体外传代数月后核型保持稳定。 2 个单细胞亚系与父系核型一样，有正常的 46 X X 核型。

表面标志

人类胚胎干细胞与未分化灵长类胚胎干细胞及人类胚胎癌细胞相似，表达碱性磷酸酶 、 SSEA-3、 SSEA-4、 TRA-1-60、 TRA-1-81、 OCT-4 等表面标志。本研究采用免疫荧光和细胞化学方法检测上述标志。

1 ) 试剂

⑴ 抗 体 ：鼠抗 SSEA-l (MC-480)、 SSEA-3(MC-631)、 SSEA-4(MC-813-70); 鼠抗
TRA-1-60(MAB4360)、 TRA-1-81(MAB4381)、 OCT-4(MAB4305)。

⑵ FITC 标记山羊抗小鼠 IgG(ZF- 0 3 1 2 ) 。

⑶其余同 3.1.2.4。

2 ) 方法

⑴ 碱 性 磷 酸 酶 检 测 ：方法同 3.1.2.4。

(2) 免疫荧光：所有免疫荧光的反应均在 35m m 组织培养皿中进行。细 胞 用 4 % 多聚甲酸固定， P B S 清 洗 3 遍 ，加 入 1 0 % 山羊血清室温下孵育 30 min，以中和非特异结合位.点 ；加人一抗 (1 : 2 0 0 稀释)， 4 ¾ 孵育过夜； P B S 清 洗 3 次 ，每 次 5 min，然后加入炎光标记的二抗 (1 : 5 0 稀释)，避 光 4℃ 孵 育 lh; P B S 清 洗 3 次 ，每 次 5 min。每 皿 加 入 1.5 mlP B S 液 ，立即在荧光显微镜下观察结果。

3 ) 结果

本研究所培养的 4 个系细胞均表达碱性磷酸酶、 SSEA-3 弱阳性、 SSEA-4 强阳性、TRA-1-60 阳性、 TRA-1-81 阳性、 OCT- 4 阳性，而 SSEA -I 阴性，与文献报道的灵长类胚胎干细胞、人胚胎癌细胞以及人类胚胎干细胞表面标志一致 (图 3.14)。

 

体内分化

将细胞注射入重症联合免疫缺陷小鼠 (SCID-biege 鼠)，胚胎干细胞在这种小鼠体内生长、分化、形成包含有三个胚层来源的良性畸胎瘤。

1 ) 方法

细胞用胶原酶消化，离 心 ，沉 淀 用 PBS 悬 浮 ，浓度大约为 IO7 个/ml, 用 Im l 注射器将细胞悬液注入小鼠后腿肌肉，每 侧 0.1 ml(约 IO6 个细胞)。共 注 射 4 只小鼠 ， 一 个细胞系 1 只小鼠，分别注射至两侧后腿。置层流柜中饲养。 8——10 周后可见小鼠腿部有肿块长出 ， 1 6 周处死小鼠，肿 瘤 用 4 % 福尔马林固定，石蜡包埋，切片 ，普 通 H E 染色后显微镜下观察。
2 ) 结果

肿瘤组织中包含有三个胚层来源的组织细胞：鳞状上皮、神经组织，为外胚层来源;骨和软骨、横纹肌、骨骼肌、血细胞和骨髓细胞等，来源于中胚层；柱状上皮、肠管样组 织 ，来源于内胚层。

小结

本研究所培养的 4 个细胞系的细胞呈集落状生长，集落形态与灵长类胚胎干细胞和人类胚胎癌细胞的集落形态相似，扁平状，细胞界限清楚；集落内细胞核大、核仁清楚，胞核与胞质的比率高。4 个细胞系核型均正常，B 4 为 46 X X ,B 7S 46 X Y J K U 1 为 46 X X ，P K U 2 为 46 X Y 。体外传代数月后核型保持稳定。 2 个单细胞亚系与父系核型—样 ，有正
常 的 46 X X 核型；4 个细胞系的细胞均表达碱性磷酸酶、 SSEA-3 弱阳性、 SSEA-4 强阳性、 TRA-1-60阳性、 TRA-1-81 阳性、 OCT-4 阳性，而 SSEA-I 阴性。与灵长类胚胎干细胞、人胚胎癌细胞以及人类胚胎干细胞表面标志一致。

将细胞注入重症联合免疫缺陷小鼠 SCID-biege 鼠的后腿肌肉中，可形成良性畸胎瘤 。肿 瘤 用 4 % 福尔马林固定，石蜡包埋，切 片 ，普 通 H E 染 色 。可见肿瘤组织中包含有三个胚层来源的组织细胞：鱗状上皮、神经组织，为外胚层来源；骨和软骨、横纹肌 、骨骼肌、血细胞和骨髓细胞等，来源于中胚层；柱状上皮、肠管样组织，来源于内胚层。本研究所建立的 4 个细胞系的细胞均来源于人类的囊胚；具有典型的灵长类和人类胚胎干细胞的生长特点及表面标志；有正常、稳定 的 46 X X 或 46 X Y 核 型 ；可长期培养不分化，保持多向分化潜能；能形成单细胞株，并保持同样的分化潜能。符合人类胚胎干细胞的特征，因此， 4 个 系 及 2 个单细胞亚系均为典型的人类胚胎干细胞系。

小鼠胚胎干细胞定向诱导分化

诱导小鼠胚胎干细胞分化的常用方法

悬 浮 培 养 法

小鼠胚胎干细胞在细菌培养皿中培养，细胞不能贴壁而需悬浮，细胞相互黏附在一起 ，形成小团状，称为拟胚体 (embryoidbody，EB)。
1 ) 实验方法

将 IO⁶〜 IO⁷ 个胚胎干细胞接种到 90m m 细菌培养皿，加入不含 L I F 的干细胞培养液，每 2 天更换一次培养液；或 者 将 20〜 30ul 胚胎干细胞悬液滴在细菌培养皿皿盖上，皿内
加 入 I O m l P B S 液 ，放入培养箱中培养，2 天后，将皿盖上的小细胞团转入皿内继续培养。后一种方法即为悬滴法 (hanging-drop culture)，这种方法可使拟胚体的大小比较均一。拟胚 体 培 养 6——10 天 ，用不同的培养基、加入不同的细胞因子，拟胚体细胞可向不同的细
胞分化。

2 ) 实验结果

细胞悬浮条件下培养，自动聚集成细胞团，进行性长大，约 3——4 天分化成为囊实性结构，即囊性拟胚体，又称为成熟性拟胚体。一周后拟胚体增大不明显。在拟胚体长大过程中，胚胎干细胞自然分化为各种成熟程度不同的细胞。拟胚体接种到组织培养皿后贴壁、展开，可出现各种组织细胞类型，包括神经细胞、可跳动的心肌细胞、血管内皮细胞等。拟胚体细胞分散后接种至组织培养皿中再加入无血清 N 2 培养液和 lOng/ml 碱性成纤维生长因子 (basic fibroblast growth factor,bFGF)， 然后 b F G F 撤退，出现典型神经样细胞。

共 培 养

共培养 (co-culture) 这种胚胎干细胞诱导分化方法已越来越引起关注。 O P 9 分离自骨硬化病突变小鼠 (po/po mutant mice) 头盖骨的间质细胞系，这种细胞不能产生巨睡细胞集、落刺激因子 (macrophage colony-stimulating factor,M -CSF)，常用于诱导造血干细胞、内皮细胞、神经细胞的分化。 N I H 3T 3 胚胎鼠成纤维细胞系，可用于诱导神经细胞分化。 P A 6分离自头盖骨的骨髓间质细胞系，常用于诱导神经细胞分化，也可用于诱导造血干细胞分化。一种支持细胞可以使胚胎干细胞向不同的方向分化，而分化方向的差别就在于所使用的培养液。

诱导小鼠胚胎干细胞向造血干细胞与血管内皮细胞分化

以向造血干细胞与血管内皮细胞分化为例。在胚胎发生中，中胚层是位于内、外胚层间的一片细胞。当中胚层细胞从上皮样结构分化为间充质细胞时，细胞黏附分子 E -cadherin(上皮性钙黏着蛋白) 表达下降，其中一个亚群中的血管内皮生长因子_2(PDGF-2)，在小鼠其被称为胚胎肝激酶-l(Flk-l)，表达升高。 Flk-I+细胞群含有内皮细胞前体。随着胚胎发育， Flk-I+细胞群在卵黄囊中产生血岛，由圆形造血干细胞及其外围的内皮细胞组成。不 表 达 Flk-I 的突变鼠不能产生血岛，在胚胎发育早期死亡。另外在中轴旁 (paraxial) 中胚层中可以识别出表达血小板源性生长因芋受体 a (PDGFa) 的细胞群，这群细胞可以产生内皮细胞，而不产生造血干细胞；而 Flkl+细胞群位于外周 (lateral)中胚层，是内皮细胞和造血干细胞的一个共同来源。在血管发生中，起源于中轴旁和外周中胚层的内皮细胞共同形成血管丛，贯穿于卵黄囊和胚体，并改造成分支复杂的血管网。

造血干细胞发生中，首先出现原始红系细胞，其可能来源于外周中胚层。类红系细胞 、类髓样细胞和类淋巴细胞均来源于表达血管内皮黏附分子 V E -钙黏着蛋白的内皮细胞 。在胚胎发育早期，内皮细胞和造血干细胞的许多标志都是相同的，如 P E C A M -1、C D 34、 A A 4 等 ，这就说明了内皮细胞和造血干细胞在发生过程中的密切关系，因此通过表型将两者分开很困难。

采用悬浮培养和共培养这两种方法均可诱导小鼠胚胎干细胞分化为造血干细胞和血管内皮细胞。本文将介绍共培养方法，即采用 O P 9 细胞系作支持细胞。流程图如图 3.15所示。
 

试剂

1)E S 细胞分化培养液

M E M 、 1 0 % F C S 、 2M E 、 50U /m l 青霉素、 50U /m l 链霉素。

2)0 P9 培养液M E M 、 2 0 % F C S 、 50U/ml 青霉素、 50U/ml 链霉素。

3) 中胚层细胞分化与纯化试剂

① 胶 原 I V 包 被 组 织 培 养 6 孔 板 ；② 细 胞 分 散 缓 冲 液 ；③ P B S (无 Ca2+， M g 2+);

④ anti-Flk-1，突光标记单抗；⑤ anti-E -cadherin, 荣光标记单抗；

⑥ H B S S /B S A : H a n k 平衡盐溶液，加 1 % B S A ; ⑦ H B S S /B S A /PI: HBSS/BSA 加 5|ag/ml 碘化丙锭。

4) 从 Flk-I+细胞中分化内皮细胞试剂① anti-VE-cadherin，荧光标记单抗；（DHBSS/BSA、 HBSS/BSA/PI。

5) 从内皮细胞中获得造血干细胞试剂
(i) 红细胞生成素 (EPO) ; ②干细胞因子 (SCF) ; ③白细胞介素 3(IL-3);④白细胞介素7(IL-7);⑤ Flk-3 配体。

方法

1 ) 中胚层细胞的诱导与纯化
向胶原 I V 包被 的 6 孔板中每孔加入 E S 细 胞 IxlO4 个 ，加 入 5m l 分化培养液， 37 ℃、5% C 0 2 条件下培养 4 天。然后吸掉培养液，加 人 2m l 细胞分散液 37℃ 孵 育 20 min，将细胞从皿底吹下。在细胞悬液中加入小鼠血清 (IO7 个/1004)，冰上放置 20 min。加 人 anti-Flk-1、anti-E -cadherin，冰上放置 20 min，用 H B A A / B S A 洗 2 遍 ，然后用 H B S S /BSA/PI 悬浮细胞 ，去除死亡细胞。用流式细胞仪筛选 Flk-r /E -cadherin— 细胞。中胚层细胞表达 Flk-1 不表达 E-cadherin。

2 ) 从 Flk-I+细胞中分化内皮细胞
加 3xl 〇 5 个 Flk-r /E -cadherirT 细胞至胶原 I V 或明胶包被的 6 孔板中，加 入 3m l 分化培养液， 3 7 ℃ 、 5 % C 0 2 条件下培养 3 天。用细胞分散液收获细胞，细胞悬液中加入小鼠血清 (IO7 个/1000)，冰上放置 20 min。加人 anti-V E -cadherin，冰上放置 20 min，用 HBAA/B S A 洗 2 遍 ，用流式细胞仪筛选 V E -cadherin+细胞。

3) E S 源内皮细胞集落分析
在开始培养 Flk-I+细 胞 前 3 天 ，在 3 个 6 孔板中接种 OP9 细 胞 ，每孔加入 2 ml OP9培养液。 3 天 后 ， OP9 细胞汇合。每孔加人 5000 个 Flk-I+细胞，再 过 3 天 ，在 OP9 细胞上可见一层细胞长出，可继续保持数天。

4 ) 从内皮细胞获得原始红系细胞
Flk-I+细胞接种至 O P 9 间质细胞上，每 孔 IxlO4 个细胞，每孔加入分化培养液 2 ml、2U /m l E P O , 4 天后检测造血干细胞。

5 ) 从 VE-cadherin+细胞获得造血干细胞
将 VE-cadherin+细胞接种至汇合的 OP9 间质细胞培养瓶内，每 瓶 加 人 IxlO4 个细胞，加 人 6m l 分化培养液及各种细胞因子，具体如下：
红系和髓样细胞分化： EP0 2U/ml、 C S F 100U/ml、 IL-3 200U/ml。
淋巴系分化： S C F 100U/ml、 IL-7 60U/ml、 Flk-3 配体 50U/ml。

每 3——4 天更换培养液，通 常 2〜 3 天后红系出现、表 达 Te-119; 5〜 7 天髓样细胞出现，表 达 Cr-1、 Mac-1; 10——14 天 B 淋巴细胞出现，表 达 CD19’。