以AtT20脑垂体细胞作为模型进行神经内 分泌肽能系统干扰中的蛋白质组学分析实验

一、材料

1 细胞培养和裂解

（1）小鼠脑垂体 AtT20 和 AtT20 (proSAAS) 细胞系。 AtT20 .(proSAAS) 细胞系通过用包含一个新霉素抗性基因的 proSAAS 表达载体转染 AtT2 0 细胞，再利用该基因对细胞毒性药物 G4 1 8 的抗性挑选阳性细胞得到（11)。

（2）含有 1 0 % 胎 牛 血 清（Wisent Inc. ， Quebec, Canada) 和 30 pg/m L 硫酸双生霉素的 DMEM 培 养 基（Gibco/BLR, Grandlsland, N Y)，含或不含 500 pg/mL的 G418 (Gibco/BLR)。

（3）磷 酸 盐 缓 冲 盐 溶 液（PBS): 1. 35 mol/L 的 NaCU 28 mmol/L 的 KC1， 80mmol/L 的 Na2 HPO4 • 7 H20 ， 15 mmol/L 的 KH2PO4， pH 7. 2。

（4）Versine: 含 0.I mmol/L EDTA 的 PBS。

（5）缓 冲 液 B: 10 mmol/L 羟 乙 基 哌 嗪 乙 磺 酸（HEPES) -KOH， pH 7.4， 10mmol/L KC1, I.5 mmol/L MgCl2，0.5 mmol,』L EGTA 钠 ， I mmol/L 二硫苏
糖 醇（DTT)。

（6）蛋 白 酶 抑 制 剂（ PIC) 片 剂（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany): 一片 溶 于 10 m L 缓 冲 液 B

（7）Corning 细 胞 刮 刀（Sigma-Aldrich, St Louise, MO)。

（8）注 射 器（3 mL) 和 针 头（2 6 目）。

（9） 蛋白质浓度测定试剂盒（Bio-Rad, Hercules, CA)。

2 双向凝胶电泳

（1）IPGphor 胶条槽， 18 cm (AmershamBiosciences, Piscataway, NJ)。

（2）IPGphor 等电聚焦系统（Amersham Biosciences)。

（3）Hoeffer DALT 电泳系统（Amersham Biosciences)。

（4） pH 4〜7L 的固相 pH 梯 度（IPG) 胶条， 18 cm (Amersham Biosciences， Uppsala， Sweden)。 保存于一 20°C 。

（5）水 化 上 样 缓 冲 液（RB) : 7 m o l/L 尿 素 ， 2 m o l/L 硫 脲 ， 4 % CHAPS,1 % DTT

（6）BiaLyte 3/10 两性电解质（Bio^Rad)。保存于 4°C 。

（7）矿 物 油（Bio——Rad)。

（8）IPG 胶条平衡缓冲液（EBl): 50 mmol/LTris-HCl， pH 8.8, 6 mol/L 尿素，30% (V/V) 甘油， 2 % 十二烷基磺酸钠（SDS)， 1 % DTT, 1X 10-4% 溴酚蓝。

（9）IPG 胶条平衡缓冲液（EB2): 50 mmol/L Tris-HCl, pH 8.8, 6 mol/L 尿素，3 0 % (V/V ) 甘油， 2 % SDS， 4 % 碘乙酰胺， 1X 10-4% 溴酚蓝。

（10） 甲叉双丙烯酰胺溶液（30_8%T ) (神经毒，戴手套!）： 3 0 % 丙烯酰胺， 0.8%
甲叉丙烯酰胺。保存于 4°C 。

（11）1 0 % SDS。

（12）1 0 % 过硫酸胺。

（13） 四甲基乙二胺（TEMED， BitRad)。

（14） SDS 电泳缓冲液： 25 mmol/L Tris, 192 mmol/L 甘氨酸， 0.1% SDS。

（15）低熔点琼脂糖（LMT) (Gibco/BLR)。通过微波炉加热溶解 1 % L M T 至 SDS电泳缓冲液中。在使用前保持 50°C 。

（16）银染溶液：a固定液： 3 0 % 乙醇， 5 % 乙酸；b 敏化液： 0.02% 硫代硫酸钠；c银染试剂： 0 . 2 % 硝酸银。d 显影液： 4 % 碳酸钾， 0.025% 甲醛(37%); e 停显试剂： 4 % Tris 碱 ， 2 % 乙酸。

（17）Umax Powerlook 1100 扫 描 仪（Umax Technologies, Dallas, TX)。

3 基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOFMS)

（1）胰蛋 白 酶（cat.no. V5111， Promega, Madison， WI)。

（2）ZipTip (：18 移 液 吸 头（Millipore， Bedford, MA)。

（3） 基质溶液： 10 m g/m L 的 a-氰-4-羟基肉桂酸溶于含〇.1% 三氟乙酸的 50% 乙腈。

（4）Voyager DETm-P R O 基 质 辅 助 激 光 解 吸 电 离 - 飞 行 时 间 质 谱（MALDI-TOF)(PerSeptive Biosystems, Framingham, MA)。

（5）MALDI 板（PerSeptive Biosystems， Framingham, MA)。

4 免疫印迹

（1） 硝酸纤维素膜（Bio-Rad)。

（2）Towbin 缓冲液： 25 mmol/L Tris, 192 mmol/L 甘氨酸， 0.1% SDS， 2 0 % (V/V) 甲醇。

（3）IX T ris 缓 冲 盐 溶 液（1XTBS): 10 mmol/L Tris-. HCl， pH 8_0， 150 mmol/L NaCl

（4） TBS——T : I X TBS, 0.1% Tween-20。

（5）5 % 脱脂牛奶溶液： TBS^T , 5 % 脱脂牛奶。

（6）ECL™ 抗兔抗体，辣根过氧化物酶链接的 F Ub’)2 片 段（来自驴）（ AmershamBiosciences)„

（7）Western Lightning 化学发光试剂（PerkinElmer, Boston, MA)。

二、方法

1 样本制备

（1）将 AtT2 0 和 AtT20 (proSAAS) 细 胞 用 150 m m 的 培 养 皿 培 养（每 种 细 胞 3盘），加 人 DMEM，在 37°C ， 5 % C0 2- 9 5 % 空 气 的 润 湿 环 境 中 生 长 至 满 。AtT20 (proSAAS) 的培养基添加了 500fxg/mL 的 G418。

（2）每次用 10 m L 的 PBS 漂洗单层细胞 3 次。

（3）用 Versine 覆盖细胞；用细胞刮刀将细胞从板上刮下，将细胞悬液转移到离心管中。

（4）4°C 1300 g 离心 5 min 沉淀细胞。移出并丢弃上清液。

（5）如上所述再次离心来移去残留的 Versine。

（6）用 0.5 mL 的含 PIC 的缓冲液 B 重悬细胞，用带有 2 6 目针头的注射器推拉 3 0 次来破裂细胞。

（7）将裂解产物 4°C , IOOOg 离 心 7 min。将上清液转移到新管子中并丢弃沉淀。

（8） 4°C 下 l 〇 V 离心上清 30 min，将 上 清 液（细胞质成分）转移到新的管子中并保
留 沉 淀（微粒体成分)。

（9）加 3 倍体积的丙酮到每份细胞质成分中并置于一 20°C lh ，沉淀蛋白质。 4°C 下15 800 g离 心 15min 。弃去上清液，保留沉淀。

（10）用超声处理法将每份细胞质沉淀或微粒体蛋白溶于 500 的 R B 中（见注释1)

（11）使用 Bio——Rad 蛋白质浓度测定试剂盒， Bradford 法确定蛋白质浓度。

2 双向电泳

2.1 等 电 聚 焦（IEF)

2.2 十 二 烷 基 磺 酸 钠 - 聚 丙 烯 酰 胺 凝 肢 电 泳（SDS^P A G E )

3 银 染（19)

3.1 银 染（见 注 释 7)

以下步骤在振荡中进行。
(1)将凝胶浸在固定液中 30 min。

(2)更换固定液再振荡 30 min。

(3)用水漂洗凝胶 5 次 ，每 次 5 min。

(4)在敏化液中孵育凝胶 lmin。

(5)用水漂洗凝胶 2 次 ，每 次 lmin。

(6)在银染试剂中孵育凝胶 30 min。

(7)用水漂洗凝胶 2 次 ，每 次 lmin。

（8）在显影液中孵育凝胶直到蛋白质斑点出现。

（9）用停显试剂终止显影 30 min。

（10） 用水漂洗凝胶 3 次，每 次 5 min。

3.2 2D 图像获取

银染凝胶在 Umax Powerlook 1100 扫 描 仪（图 1 ) 上扫描，保存数子图像。

4 银染胶脱色 （20)

（1）切取感兴趣的凝胶斑点。

（2）按 1 : 1 的比例混合 30 mmol/L 的铁氰化钾和 100 mmol/L 的硫代硫酸納。

（3） 用 100 uL 以上溶液覆盖凝胶片。

（4） 室温下振荡直到银染去除。

（5） 每次用 500 uL 水漂洗凝胶片，并更换水数次直到黄色试剂去除。

（6） 在 200 uL 200 mmol/L 的碳酸氢氨中孵育凝胶片 20 min 并振荡。

（7）用 500 水漂洗凝胶片 2 次 ，每 次 lmin。

（8）离心并除去水。

5 胰 酶 消 化 （21， 22)

(1)将凝胶片在 200 uL CH3CN 中孵育 10 min。

(2)离心并除去 CH3CN。

(3)SpeedVac 真空离心蒸发浓缩凝胶片 15 min。

(4)56°C 下在 100 )nL 100 mmol/L NH4 HCO3, 10 mmol/L DTT 中孵育凝胶片45 min

(5)离心并除去 D T T 溶液

(6)加 100 100 mmol/L NH4 HCO3， 55 mpol/L 碘乙酰胺，并在室温下黑暗中孵 育 30 min。

(7） 离心并除去碘乙酰胺溶液。

(8)在 100 100 mmol/L NH4 HCO3 中振荡漂洗凝胶片 lOmin。

(9) 离心并除去 NH4 HCCV 溶液。

(10) 室温下在 100 pL CH3C N 中脱水凝胶片 5 min。

(11) 离心并除去 CH3CN

(12)在 100 uL 100 mmol/L NH4 HCO3 中振荡漂洗凝胶片 5 min。

(13)离心并除去 NH4 HCO3 溶液。

(14)室温下在 100 uL CH3CN 中脱水凝胶片 5 min。

(15)离心并除去 CH3CN。

(16)SpeedVac 真空离心蒸发浓缩凝胶片 15 min。

(17)在冰上用 20 含 500 ng 胰酶的 50 mmol/L NH4 HCO3 泡胀凝胶片 30 min。

(18)去除残留的胰酶溶液，并 加 50 mmol/L 无胰酶的 NH4 HCO3 覆盖凝胶片。

(19)37°C 下消化凝胶中的蛋白质过夜。

(20)离心并将上清转移到新會子中。

(21)加 50 uL 50% C H 3 C N , 0 . 1 % 三氟乙酸到凝胶片上并在冷水浴中超声处理 3 min。

(22)离心并转移上清到最初的上清中。

(23)再重复步骤 2 1 和 22 两次。

(24）SpeedVac 真空离心蒸发浓缩上清液直到体积小于 10 uL。

(25）加0 . 1 % 三 氟 乙酸至 10 uL 。

6 胰蛋白酶肽段 MALDI-TOF 质谱分析

（1）在 MALDI-TO F 分析之前，按照制造商说明书用 ZipTip C18 移液吸头纯化胰蛋白酶消化的肽段。

（2）将纯化的肽段用 2 uL 基质点在 M A L D I 板上。

（3）用以下仪器设定采用延迟提取和反射模式进行质谱分析： 20 k V 加速电压， 150ns 延迟时间， 7 0 % 栅极电压， 0.05% 导向线电压， 128 激光发射，激光强度2000, 质量门从 800 到 2800。m/z 842. 5 1 和 m/z 1045. 5 6 的胰酶自降解产物用于 内部质量校准（图 2)。

（4）选择单同位素峰的质量，通过使用搜索引擎 PeptIdent (http://www.expasy.ch/tools/peptident.html) 搜索 Swiss-Prot 和 TrEMBL 数据库，与相应理论质量匹配在 50 ppm® 之内来鉴定蛋白质。

7 2D 免疫印迹

（1）如 3. 2 所述重复制备 2D 凝胶。

（2）根据制造商用户手册，在 含 Towbm 缓冲液的 Hoefer SE 600 槽中将蛋白质点从未染色的凝胶上转移到硝酸纤维素膜上。

（3）用 5% 脱脂牛奶溶液封闭膜。

（4）室温下将膜在含抗-EphA2 —抗 的 5 ¼ 脱脂牛奶中孵育 lh 。

（5）在 TBS”T 中漂洗膜 4 次 ，每 次 5 min。

（6） 在 含 HRP-结合的驴抗兔 IgG 的抗体的脱脂牛奶溶液中孵育膜 lh 。

（7）在 T B S T 中漂洗膜 4 次，每 次 5 min。

（8） 根据制造商方案，用 Western Lightning 化学发光试剂显示免疫反应斑点（图3)。

（1） 样品蛋白的完全增溶、去解聚、变性和还原是用 2D 凝胶分离蛋白质能否成功的关键。因此，蛋白质沉淀需在 R B 中用超声处理至少 3 min 以溶解。因为尿素在较高温度下可以降解为异腈酸盐，导致蛋白质氨甲基化，所以超声处理在冰水浴冷却下用 cuphorn 超声仪进行。

（2）IPG 胶条槽是用陶瓷制成的，使用时小心。

（3）为了避免污染，带手套工作。不要让 IPG 胶条下存留气泡。

（4） 这 里 用 来 制 备 溶 液 的 水 必 须 拥 有 以 上 的 电 阻 率 。

（5）20 cm 长带盖子的玻璃管用于平衡很理想。

（6）避免在 IPG 胶条和 SDS 胶之间存留气泡。

（7）银染是最敏感的可视化方法。为得到高质量的结果，应使用高纯度的试剂并戴手套以避免污染。