cDNA文库的构建和筛选 —在外界环境压力条件下，新表达基因的鉴定方法实验

一、材料

所有化学试剂均为分子生物学级纯度。所用塑料和玻璃制品，包括瓶子和移液器吸头均经高压蒸气灭菌。涉及核酸的操作均需带手套。

1.总 RNA提取

（1）无 RNase 水。加 I mL 焦 炭 酸 二 乙 酯（DEPC) (Sigma-Aldrich) 到 I L 水中(0.1%， V/V) , 搅 拌 过 夜（> 1 2 h)，高压蒸气灭菌。这可使得存在于水中的RNase 失活，处理过的水用于本节中溶液的配制和溶解 RNA 样品。

（2）TRIzo〖试 剂（Invitrogen)。

（3）氣 仿（Fisher Scientific)。

（4）异 丙 醇（Fisher Scientific)。

（5）7 0 % 乙醇，加 30 mL DEPC 处理的水至 70 mL 无水乙醇中。

（6）Oligo (dT) 纤 维 素（New England BioLabs， NEB)。干燥的 Oligo (dT) 纤维素与 0 •I mol/L NaOH 混合使其成浆状，填充入一个无菌的柱子或 I mL 灭菌棉花或者玻璃丝塞住的注射器。在加样前先用上样缓冲液平衡柱子。

（7）上样缓冲液： lm ol/LNaCl， 2 mmol/L 磷酸缓冲液， PH7.2。

（8）洗漆缓冲液（middle wash buffer) : 上样缓冲液+0.3 mol,+LNaCl。

（9）洗脱缓冲液（elution buffer): 10 mmol/L Tris——HCl， pH7. 2〜7. 4 ， I mmol/LEDTA

（10）3 mol/L 乙酸钠， pH 5. 2。

（11）乙醇。

2 cDNA 文库的构建

3 CDNA 文库的扩增

（1）NZY 平 板（24 cmX24 cm )， LB-氛卞青霉素肉汤， XLl-Blue 菌种 ， NZY 琼脂，NZY 上 层 琼 脂（见 2 中 第 19、 20 项）。

（2）TSM 缓 冲 液（见 2 中 第 16 项）。

（3）氯 仿（Fisher Scientific)。

（4）二 甲 亚 讽（DMSO; Sigma-Aldrich)。

4 cDNA 文库差异表达的筛选

（1） NZY 平 板（24 cmX24 cm, 见 2 中第 19、 20 项）

（2）Hybond-14 0.45/1111 孔径的尼龙膜（GE Healthcare)。

（3）20XSSC: 3 mol/L NaCl， 0. 3 mol/L 柠 檬 酸 钠（I L 配方： 175 g NaCl， 88 g柠檬酸钠）；用蒸馏水稀释。

（4）变性缓冲液： I.5 mol/L NaCl, 0. 5 mol/L NaOH。

（5）中和缓冲液： I. 5 mol/L NaCl, 0. 5 mol/L Tris-HCl， pH 8. 0。

（6）冲洗缓冲液： 0.2mol/LTris-HCl， p H 8. 0, 2XSSC。

（7）Whatman 滤纸或层析纸（Fisher Scientific)。

（8）dNTPs (dATP、 dTTP、 dGTP 各 1 0 mmol/L)。

（9）固定的 Oligo (dT) 引物： 5’ - dT (15) A/G/C-3、 可 购 买 商 业 化 产 品（Invitrogen； New England Biolabs) 〇

（10）Nasin (20 U/μL, Promega)

（11）二 硫 苏 糖 醇（DTT) (Sigma-Aldrich)，用无菌水配置成〇• I m ol/L 储存液。

（12）A M V 反 转 录 酶（10 U/μL) 和 10X 反转录缓冲液（Promega)。

（13）[α^-32P] dCTP (3000 Ci/mol; GE Healthcare) 。

（14）RNaseA (60 mg/mL, Sigma-Aldrich)0

（15）快 速 离 心 柱（quick spin column) (TE; Sephadex 0 2 5 ， Fine)，用于放射性标记的 DNA 纯 化（Roche)。

（16）IX T wEl 缓冲液： 10 mmol/L Tris-HCl, pH 8. 0 ， I mmol/L EDTA。

（17）杂交缓冲液，改良的 Church’s 缓冲液： 0.25 mol/L Na₂ HPO₄, 0.25 mol/LNaH₂ PO₄ (PH 7. 5)， lmmol/LED TA， 7 % 十二烷基磺酸钠（SDS; W/V );或够买商业化的缓冲液； Ultrahybe (Ambion)。

（18）洗膜缓冲液（membrane washing buffer): 0. 1XSSC， 0 •1 % SDS (W/ V)。

（19）膜清洗缓冲液（membrane rinsing buffer): 0.1 X SSC。

（20）X 光 片（Koda)。

(21)TSM 缓冲液：（见 2 中第 16 项）。

(22)氯仿（Fisher Scientific)。

(23)XLl-Blue 培养基。

(24) N ZY 上 层 琼 脂（见 2 中第 19、 20 项）。

5菌体内克隆的检出

(1)XLl-Blue 菌种。

(2)10 mmol/L MgSO₄。

(3)ExAssist helper 嗤菌体。

(4)Uni-ZAP X R 噬菌体储存液。

(5)LB- 氨苄青霉素肉汤（见 2 中第 18 项）。

(6)SOLR 细胞。

(7)L B 氨苄青霉素琼脂平板： 15 g 琼脂粉加至 L B 肉 汤 中（I L)，高压蒸气灭菌。冷却至 50°C 以下铺平板，加人氨苄西林（lOOpg/mL) , 用恰当厚度铺板。

6 质粒的小量抽提

（1）LB-氨苄青霉素肉汤（见 2. 2 中第 18 项）。

（2）预裂解缓冲液： 5 0 mmol/L 葡萄糖， 2 5 mmol, LTris-HC1， p H 8. 0, lOmmol/LEDTA

（3）RNase A (见 4 中第 14 项）。

（4）碱裂解缓冲液：0. 2 mol/LNaOH， 1% S D S , 该溶液需用之前新鲜配制。

（5）中和缓冲液： 5 m olZL 乙酸钾， 30% 乙酸， 50 mm 〇 r L 葡萄糖， 25 mmol/LTris-HCl， pH 8. 0， 10 mmol/L EDTA0

（6）异 丙 醇（FisherScientific)

7.70% 乙 醇（见 2. 1 中第 5 项）。

7 插入序列的分离

（1）限制性内切酶： E co R I 和 Xho I (N ew EnglandBiolabs); 可根据接头调节。

（2）IOX 限制性内切酶缓冲液，使用限制酶所附带的缓冲液。

（3）DNA 上样缓冲液：0. 25% (W /V ) 二甲苯氰， 0. 25% (W / V ) 溴酚蓝， 50% 甘油。

（4）1% T A E 琼脂胶和 50X T A E 缓 冲 液（见 2. 2 中第 11、 12 项

（5）DNA 分子质量标准（Invitrogen)，由表达克隆片段的大小而定（从 100 bp 到几kb)。

（6）带滤芯的移液器吸头（Im L )。

（7）灭菌棉花或玻璃丝。

8 标记探针的合成

9 Northern 印迹

（1）10X MOPS 缓冲液： 200 mmol/L MOPS， 50 mmol/L 乙酸納， 10 mmol/L EDT A , pH 7. 0。

（2）I. 25% 甲醛变性胶：将 3.75 g 琼脂糖溶于 217 m L 双蒸水中，加 E B 至终浓度 Iμg / m L , 将该溶液 放 置 于 60°C 培养箱中。另取一灭菌瓶，加 人 30 mL IOX MOPS 缓冲液， 53 mL (37% , W ) 甲醛，将该溶液放人 60°C 培养箱中。等到两种溶液都平衡至 6 〇°C 后，将它们混合，轻轻旋转混勻，注意不要产生气泡，倒入较大的制胶板中。

（3）RNA 样品溶解缓冲液： IXMOPS 缓冲液， 2.2 mol/L 甲醛， 5 0 % 甲 酰 氨（V/V )。

（4）6X R N A 上 样缓冲液 ： I X MOPS 缓冲液， 5 0 % 甲 酰 氨（V/V )， 4 0 % 甘油(V/V )，加入几滴溴酸蓝和二甲苯氰作为示踪染料。

（5）HybondO.45 pm 孔径的尼龙膜（GE Healthcare)。

（6）20XSSC (见 4 中第 3 项），必要时用蒸馏水稀释至所需浓度。

（7）Whatman 滤纸或层析纸（Fisher Scientific)。

（8）纸巾。

（9）测序胶板。

（10）压重物。

（11）玻璃或塑料吸管（5 或 IOmL) , 用来驱除转膜装置中的气泡。

（12）塑料薄膜。

（13）Northern 印迹法的固定液： 0 •05 mol/L NaOH。

1 0 用探针检测 Northern 印迹

（1）杂交液： Ultrahybe 杂交缓冲液或者改良的 Church』 s 缓 冲 液（见 4 中 第 17项)。

（2）放射性标记的探针（见 2. 8)。

（3）Northern 杂交洗液：用蒸馏水配置 0. 1XSSC， 0.1% SDS。

（4）X 光片。

（5）Northern 印迹洗脱液：煮沸含有 0.5% SDS 的双蒸水，将印记膜放入，用盖革计数器检测直至放射信号低于背景水平。

二、方法

已有针对特定的实验（基因的高或低拷贝等）而设计的商业化产品来检测和鉴定差异表达的基因。尽管技术的发展日新月异，但从感兴趣的组织/器官/有机体中分离mRNA 构 建 cDNA 文库仍然是鉴定新基因和蛋白质的标准方法。有很多成熟的试剂和产品可供选择来构建一个文库；本章介绍了一种通用的标准方法用于构建文库，筛选阳性克隆并对其分析。这些实验方法使用了 Uni-Zap-cDNA 合 成 试 剂 盒（Stmtagene)(5)，但也可以修改后用于其他载体。一些通用的噬菌体克隆载体包括 plTriplEX(Clontech)、 pSPORTl (Invitrgen) 和 ISCREEN-1 (Novagen) , 但不局限于这几种。文库构建之后，用表达差异筛选来鉴定在测试条件下受诱导或抑制的基因克隆。这 里 我 们 以 新 基 因 的 鉴 定 为 例 说 明 具 体 的 实 验 步 骤 ，该基因在海蜗牛的肝胰腺组织中表达，并在缺氧条件下被诱导。这种表达上调被 Northern 印迹所证实。似印-2克隆的序列测定后，进一步的序列分析参见 3. 11。

1 总 RNA 的提取分离

（1）现今有许多试剂盒可用于总 RN A 和 mRNA 的 分 离（Ambion、 Roche、 Qiagen、Invitrogen、 Novagen 等）。这些试剂盒可获得高纯度和高质量的 RNA， 但相对来说价格较贵。这里我们介绍了传统常规的 RN A 抽提方法。

（2）每 100 mg 组织加入 Im L TRIz0I 匀浆，并加入 0.2 m L’ m L 氯仿。颠倒混匀 15s，室温放置 2〜3 min。 4： ° C ， 12 000 g■离心 15 min。

（3）转移上层水相至一新的 Eppendorf 管，加入等体积的异丙醇沉淀 RNA。在室温放置 10 min。

（4）4°C ，最高转速离心 10 min。移去上清，用 250 pL 7 0 % 乙醇洗涤沉淀，最高转速离心 5 min。吸去乙醇，在室温空气干燥 RNA 10 min, 用适量的 DEPC 处理的 水 溶 解（假 定 10 mg 组织获得的 RNA 量 为 IOfXg)。 储 存 于 4°C (一周之内）或者一 20°C (长期保存)。

（5）用紫外分光光度计测定 260 nm 和 280 mn 光吸收值，用以确定 RN A 浓度和纯度。 A260/A 280 为 1. 6〜2. 0 为可接受的范围（见注释 1)。

（6）用结合有 Oligo (dT) 的纤维素柱子纯化 poly (A )+ InRNA。总 R N A 加热至65°C ，与上样缓冲液 1 : 1 混 合（V/V )，上样至 Olig0 (dT) 的纤维素柱。

（7）用一个柱床体积的上样缓冲液冲洗柱子，收集洗脱液于无菌 Eppendorf 管。将洗脱液再上样、收集，重复两次。

（8）分别用一个柱床体积的上样缓冲液和洗涤缓冲液冲洗柱子，最 后 用 1.5 倍柱床体积的洗脱液洗脱。最后一步使 poly (A )+ InRNA 得以洗脱，加入0.1 倍体积的 3 mOl/L 乙 酸 钠（p H 5•2)， 2•5 倍体积的无水乙醇，放置于一 20。 C 沉淀过夜。操作程序可在此停止。

（9）第二天于 4°C , 13 000 g 离心 45 min。弃上清用 7 0 % 乙醇洗 涤（250 fxL), 以相同速度离心 10 min。所获得的沉淀为 mRNA, 空气干燥并溶于 DEPC 处理的水中（见注释 2)。如果不立即用 mRNA 进行实验，则将样品储存于一 8 〇°C 。

2 cDNA 文库的合成

3 滴度测定和 cDNA 文库扩增

4 cDNA 文库的差异筛选

5 体内克隆的捡出

6 质粒的小量抽提

7 插入片段的分离提取

8 标记探针的合成

9 Northern 印迹

10用探针进行 Northern 印迹

11 克隆分析

具有差异表达的克隆应该用标准方法双向测序（不管在实验室还是在 DNA/基因组测序机构）。随后的序列分析可用商业化的软件和其他大量的在线分析工具进行。下面列出了一些优秀的进行 cDNA 和氨基酸序列分析的生物信息学软件和应用工具。
第一步， DNA 序列应被拷贝至 NCBI 的 BLAST 服务器比对已有的和注释过的序列 。相同的基因序列或与表达序列标签（expressed sequence t a g ) 的相似性可由 E 值决定 。 E 值表示每一对序列相似的可能性。当 E 值 ^{-5 意 味 着 该 序 列 比 对 不 是 由 错 误 产
生的。新的或未知的基因通常无法得到配对，但一些保守区域可得到鉴定并提供很短的序列配对。}

(1)国 立 生 物 技 术 信 息 中 心（NCBI)

http ：//www.ncbi.nlm.nih.gov/

1.Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)： http：/ /blast, ncbi. nlm. nih.gov/Blast

BLAST 首先给出了在一个序列中四个字母所表示的残基，然后由这些字母所扩展组成的片段。所使用的程序中， Wastx 用于将查询的核苷酸序列的所有可读框翻译成蛋白质序列后与蛋白质数据库中的数据比对。 tblastx 是将查询的核苷酸序列翻译后与核苷酸序列数据库翻译结果比对。 blastp 是将查询的氨基酸序列与蛋白质数据库对比。
2.ORF (可读框）finder: http://ncbi.nlm. nih. gov/gorf/gorf.htmlORFfinder 可鉴定一个核苷酸序列中所有 6 种可读框的编码区域。选择好的可读框可以直接转入 BLAST 进行保守区域或相似序列的搜索（blastp)。

（2） 基 因 的 翻 译 和 蛋 白 质 序 列 的 鉴 定

新基因功能的鉴定是当前许多大规模的基因组计划面临的挑战。 mRNA 序列包含许多信息，但常规来说蛋白质才是功能执行者。为了预测某一特定基因的功能，常常将基因序列翻译成预测的蛋白质序列来分析与已知功能蛋白的同源性和保守区域。许多情况 下 ，一 个 cDNA 克隆通常代表了一个已知的同源物。这些克隆所代表的基因或蛋白质通常可与现有的功能模式相匹 E ，因为这些基因很可能已在其他系统、器官、组织(在各类应激和环境条件下）中被鉴定出，并具有已知的作用和功能。然 而 ，如果目的克隆没有任何已知的同源物，则需进行进一步的分析和鉴定。一些用于分析新基因或蛋白质的软件如下：

PredictProtein (蛋白质预测）：

http：//www.embl-heidelberg.de/predictprotein<，predictprotein. html

将被翻译的目的蛋白质序列用 PredictProtein 服务器搜索，得到的结果是数据库中的相似序列和蛋白质结构的预测。

蛋 白 质 序 列 分 析（Protein Sequence Analysis， PSA) :

http:// bmerc-www.bu.edu/psa/request.htmPSA 根据氨基酸序列预测蛋白质的二级和四级结构。

SOSUI：

http ：//sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosui_ submit,html

该工具软件通过所输人的氨基酸序列的理化性状（如疏水性和电荷），预测膜蛋白的二级结构。

PROSITE：

http：//www.expasy.ch/prosite

PROSITE 是一个蛋白质保守域数据库。基于蛋白质的基本序列，查询得到的结果是与具有生物学意义的结构模式的匹配。

PSORT：

http ：// psort.nibb.ac.jp/

在基因被翻译成蛋白质后，氨基酸序列通常都包含了转位和定位信号的区域。这一信号决定了蛋白质在细胞内的定位并可帮助确定其功能。 PSORT 将输入序列与分选信号同义序列比较确定是否存在信号分选序列。

SignalP ：

http：//www.dtu.dk/services/SignalP

ag n alP 程序用于预测在所输入的氨基酸序列中信号肽断裂位点存在与否。

Submitting DNA sequence to NCBI GenBank：

http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/submit,html

在所研究和鉴定的 DNA 序列发表之前，必须将该序列注释后提交到序列数据库。提交的信息需包含如编码区、起始密码子和终止密码子或者其他相关信息。用互联网浏览器，新的序列通过 Bank It (基于互联网的工具）或 Sequin (独立的提交工具软件)提 交 至 GenBank。