材料与仪器
十二烷基 β-D-麦芽糖苷增溶液 TritonX-100 增溶液 洋地黄阜苷增溶液 考马斯亮蓝染色液 丙烯酰胺溶液 BN 凝胶缓冲液
步骤
3.1 BN-PAGE 样品的制备
所有样品制备步骤必须在 4°C 下操作，在开始制备样品前（见 26.3.1 节 1 和 26. 3.1 节 2) ，要制备好 BN 凝胶（见 26. 3. 2) 。
1. 膜组分
( 1 ) 按照标准的方法步骤制备要研究的膜组分，如细胞质膜、类囊体膜或线粒体膜。或者使用完整细胞器，如质体、线粒体或过氧化物酶体，作为 BN-PAGE 的初始实验材料。
( 2 ) 确定蛋白质浓度，如用 Lowry 方法等。
( 3 ) 将蛋白质浓度调为 10 μg/μl。
( 4 ) 15000 g 离心 100 μl 样品 10 min，沉淀膜或细胞器组分。
( 5 ) 用十二烷基 β-D-麦芽糖苷，Triton X-100 或洋地黄皂苷增溶液悬浮沉淀物（见注释 1)。
( 6 ) 将悬浮液置于冰上 15 min。
( 7 ) 20000 g 离心 20 min，去除不容物。
( 8 ) 加入 5 μL 考马斯亮蓝染色液。
( 9 ) 直接加样 50~100 μl 的上清液（相当于 0.5~1.0 mg 蛋白质）到 BN 胶上（蛋白质的定量为可被考马斯亮蓝染色，如用银染，蛋白质量可减少到 1/10 )。
2. 水溶解组分
( 1 ) 按照标准方法制备要研究的水溶性蛋白质，所用的缓冲液不能含高盐浓度或者离子去垢剂。蛋白质浓度要调节到 10 μg/μl。
( 2 ) 在 100 μl 样品中加入 2 μl 考马斯亮蓝染色液。
( 3 ) 20000 g 离心 20 min，去除不溶物。
( 4 ) 直接加样 50~100 μl 的上清液（相当于 0.5~1.0 mg 蛋白质）到 BN 胶上（如用银染，减少蛋白样品的加样量，见 26. 3.1 节 1 中 第（a ) 步骤）。
3.2 BN-PAGE
如果电泳分离距离大于 12 cm，BN 凝胶就可以获得最好的分辨能力。下面所介绍的方法是在 Bio-Rad 公司的 Protein II 电泳仪（Bio- Rad，Richmond，CA； 凝胶尺寸：0.15 cm X 16 cm X 20 cm) 上做的实验，其他公司生产的电泳仪，如 HoeferSE-400 或 SE-600 电泳仪（GE Healthcare, Munich, Germany) ，也同样适用于 BN-PAGE 电泳。由于蛋白复合物的分子质量可从 50 kDa 到几千 kDa，所以有时要用到梯度凝胶来分离 ( 见注释 2) 。
( 1 ) 将 1.8 ml 丙烯酰胺溶液，3.3 ml BN 凝胶缓冲液，14.9 ml 双蒸水混合在一起，配制成 4.5% 分离胶溶液。
( 2 ) 将 6.7 ml 丙烯酰胺溶液，3.3 ml BN 凝胶缓冲液，6.0 ml 双蒸水，4 ml 甘油混合在一起，配制成 16% 分离胶溶液。
( 3 ) 将这两种溶液分别灌入梯度生成器中，在这个梯度生成器上连接软管和针头，并与做胶的两块玻璃板之间的空间连接，这样就可以从顶部灌胶（16% 分离胶溶液先灌进两块玻璃板之间），或从底部灌胶（4.5% 分离胶溶液先灌进两块玻璃板之间）。
( 4 ) 在这两种凝胶溶液中加入 TEMED 和 APS ( 90 μl 10% APS/9 μl TEMED 加入到 4.5% 分离胶溶液中；65 μl APS/6.5 μl TEMED 到 16% 分离胶溶液中）。
( 5 ) 灌梯度胶，在顶部为浓缩胶留一定的空间，用双蒸水封胶液，凝胶将在 60 min 内聚合。
( 6 ) 倒掉双蒸水。
( 7 ) 将 1.2 ml 丙烯酰胺溶液，2.5 ml BN 凝胶缓冲液，11.3 ml 双蒸水混合在一起，配制成浓缩胶溶液。
( 8 ) 在浓缩胶溶液中加入 65 μl APS 和 6.5 μl TEMED，将其倒入插梳周围的空间，浓缩胶将在 30 min 内聚合。
( 9 ) 稀释相应的电泳缓冲液的浓缩储液，分别制备成 1X 的阳极和阴极电泳缓冲液。
( 10 ) 当浓缩胶聚合后，小心移走插梳。
( 11 ) 将阳极和阴极电泳缓冲液分别加到电泳仪的上、下槽内，冷却电泳仪到 4°C。
( 12 ) 将经考马斯亮蓝预处理的蛋白样品加样到凝胶凹槽里。
( 13 ) 将电泳仪与稳压电源连接，一开始时，100 V 恒定电压电泳 45 min，接着以 15 A 恒定电流电泳 8 h。要 在 4°C 电泳，电泳过程中可看到 BN 胶上的条带。
3.3 第二相的 SDS-PAGE
1D BN-PAGE 分离的蛋白复合物可用考马斯亮蓝染色或银染，用胶内酶学检测了解其活性，或转移到印迹膜进行进一步的分析（见注释 3 和注释 4) 。用第二相有 SDS 存在的凝胶电泳能分离出蛋白复合物的亚基组分，所有已发表的 SDS-PAGE 实验方法都可与 BN-PAGE 结合，如 Laemmli 发表的电泳系统 [24] 。但是一般来说，Schagger 和 von Jagow [ 25 ] 开发的 Tricine-SDS-PAGE 系统的分辨率最高。下面所介绍的方法是在 Bio-Rad 公司的 Protein II 电泳仪（Bio-Rad， Richmond， C A；凝胶尺寸：0.15 cm X 16 cm X 20 cm) 上做的实验，其他公司生产的电泳仪也同样适用。
( 1 ) 剪下一条 BN 胶，室温下将其浸泡在变性处理溶液中 30 min。
( 2 ) 用双蒸水冲洗胶条 30~60 s ( 这一步骤很重要，因为 β-巯基乙醇抑制丙烯酰胺的聚合)。
( 3 ) 将胶条放在电泳仪的玻璃板上的正常胶梳的梳齿位置上。
( 4 ) 再用 1 mm 橡皮密封条、第二块玻璃板和夹子等，组装凝胶电泳仪。将所有需要的东西倒入灌胶器中（与第一向的胶条厚度（1.5 mm) 相比，减少第二向凝胶的厚度到 1.0 mm，以避免第二向胶条沿着垂直方向滑落下去）。
( 5 ) 将 10 ml 的丙烯酰胺溶液、10 ml 的 SDS 凝胶缓冲液、10 ml 双蒸水、100 μl 的 APS 和 10 μl 的 TEMED 混合在一起，配制成 16% 分离胶溶液，将其倒入电泳仪两块玻璃板之间的 BN 胶条以下的空间，为嵌入 BN 胶条的样品胶溶液留下空间。用封胶溶液封胶面，大约 60 min 内凝胶聚合。
( 6 ) 将 4.1 ml 的丙烯酰胺溶液、6.7 ml 的 BN 凝胶缓冲液、2 ml 甘油、200 μl 的 SDS 溶液、6.8 ml 双蒸水、160 μl 的 APS 和 16 μl 的 TEMED 混合在一起，配制成 10% 样品胶溶液。
( 7 ) 倒掉封胶溶液，倒入样品胶将 BN 胶条嵌入，倾斜凝胶架子，使 BN 胶条下面的空气释放出来。
( 8 ) 分别在电泳仪的上、下槽加入 SDS 阳极和阴极电泳缓冲液。
( 9 ) 将电泳仪接上稳压电源，30 mA 电流下，电泳过夜。
作为一个替代系统，第二向电泳可在天然条件下进行（ 见注释 7) 。
3.4 染色
用所有的标准蛋白质染色方法可以显色 2D BN 凝胶上分离的蛋白质，如考马斯亮蓝染色、银染、荧光染料染色等。如果接着用质谱仪鉴定蛋白质，建议使用考马斯亮蓝染色，下面介绍由 Nenhoff 等开发的基于胶态考马斯亮蓝染色的实验指导。
( 1 ) 将凝胶在固定液中固定处理 1 h。
( 2 ) 混合 80 ml 新鲜配制的染色液和 20 ml 乙醇溶液。
( 3 ) 将凝胶浸泡在上述溶液中过夜。
( 4 ) 用双蒸水冲洗凝胶，脱色，要中途换水直至背景清晰（如果背景颜色无法用水脱除，可使用 20% 的乙醇溶液脱色）。
所有样品制备步骤必须在 4°C 下操作，在开始制备样品前（见 26.3.1 节 1 和 26. 3.1 节 2) ，要制备好 BN 凝胶（见 26. 3. 2) 。
1. 膜组分
( 1 ) 按照标准的方法步骤制备要研究的膜组分，如细胞质膜、类囊体膜或线粒体膜。或者使用完整细胞器，如质体、线粒体或过氧化物酶体，作为 BN-PAGE 的初始实验材料。
( 2 ) 确定蛋白质浓度，如用 Lowry 方法等。
( 3 ) 将蛋白质浓度调为 10 μg/μl。
( 4 ) 15000 g 离心 100 μl 样品 10 min，沉淀膜或细胞器组分。
( 5 ) 用十二烷基 β-D-麦芽糖苷，Triton X-100 或洋地黄皂苷增溶液悬浮沉淀物（见注释 1)。
( 6 ) 将悬浮液置于冰上 15 min。
( 7 ) 20000 g 离心 20 min，去除不容物。
( 8 ) 加入 5 μL 考马斯亮蓝染色液。
( 9 ) 直接加样 50~100 μl 的上清液（相当于 0.5~1.0 mg 蛋白质）到 BN 胶上（蛋白质的定量为可被考马斯亮蓝染色，如用银染，蛋白质量可减少到 1/10 )。
2. 水溶解组分
( 1 ) 按照标准方法制备要研究的水溶性蛋白质，所用的缓冲液不能含高盐浓度或者离子去垢剂。蛋白质浓度要调节到 10 μg/μl。
( 2 ) 在 100 μl 样品中加入 2 μl 考马斯亮蓝染色液。
( 3 ) 20000 g 离心 20 min，去除不溶物。
( 4 ) 直接加样 50~100 μl 的上清液（相当于 0.5~1.0 mg 蛋白质）到 BN 胶上（如用银染，减少蛋白样品的加样量，见 26. 3.1 节 1 中 第（a ) 步骤）。
3.2 BN-PAGE
如果电泳分离距离大于 12 cm，BN 凝胶就可以获得最好的分辨能力。下面所介绍的方法是在 Bio-Rad 公司的 Protein II 电泳仪（Bio- Rad，Richmond，CA； 凝胶尺寸：0.15 cm X 16 cm X 20 cm) 上做的实验，其他公司生产的电泳仪，如 HoeferSE-400 或 SE-600 电泳仪（GE Healthcare, Munich, Germany) ，也同样适用于 BN-PAGE 电泳。由于蛋白复合物的分子质量可从 50 kDa 到几千 kDa，所以有时要用到梯度凝胶来分离 ( 见注释 2) 。
( 1 ) 将 1.8 ml 丙烯酰胺溶液，3.3 ml BN 凝胶缓冲液，14.9 ml 双蒸水混合在一起，配制成 4.5% 分离胶溶液。
( 2 ) 将 6.7 ml 丙烯酰胺溶液，3.3 ml BN 凝胶缓冲液，6.0 ml 双蒸水，4 ml 甘油混合在一起，配制成 16% 分离胶溶液。
( 3 ) 将这两种溶液分别灌入梯度生成器中，在这个梯度生成器上连接软管和针头，并与做胶的两块玻璃板之间的空间连接，这样就可以从顶部灌胶（16% 分离胶溶液先灌进两块玻璃板之间），或从底部灌胶（4.5% 分离胶溶液先灌进两块玻璃板之间）。
( 4 ) 在这两种凝胶溶液中加入 TEMED 和 APS ( 90 μl 10% APS/9 μl TEMED 加入到 4.5% 分离胶溶液中；65 μl APS/6.5 μl TEMED 到 16% 分离胶溶液中）。
( 5 ) 灌梯度胶，在顶部为浓缩胶留一定的空间，用双蒸水封胶液，凝胶将在 60 min 内聚合。
( 6 ) 倒掉双蒸水。
( 7 ) 将 1.2 ml 丙烯酰胺溶液，2.5 ml BN 凝胶缓冲液，11.3 ml 双蒸水混合在一起，配制成浓缩胶溶液。
( 8 ) 在浓缩胶溶液中加入 65 μl APS 和 6.5 μl TEMED，将其倒入插梳周围的空间，浓缩胶将在 30 min 内聚合。
( 9 ) 稀释相应的电泳缓冲液的浓缩储液，分别制备成 1X 的阳极和阴极电泳缓冲液。
( 10 ) 当浓缩胶聚合后，小心移走插梳。
( 11 ) 将阳极和阴极电泳缓冲液分别加到电泳仪的上、下槽内，冷却电泳仪到 4°C。
( 12 ) 将经考马斯亮蓝预处理的蛋白样品加样到凝胶凹槽里。
( 13 ) 将电泳仪与稳压电源连接，一开始时，100 V 恒定电压电泳 45 min，接着以 15 A 恒定电流电泳 8 h。要 在 4°C 电泳，电泳过程中可看到 BN 胶上的条带。
3.3 第二相的 SDS-PAGE
1D BN-PAGE 分离的蛋白复合物可用考马斯亮蓝染色或银染，用胶内酶学检测了解其活性，或转移到印迹膜进行进一步的分析（见注释 3 和注释 4) 。用第二相有 SDS 存在的凝胶电泳能分离出蛋白复合物的亚基组分，所有已发表的 SDS-PAGE 实验方法都可与 BN-PAGE 结合，如 Laemmli 发表的电泳系统 [24] 。但是一般来说，Schagger 和 von Jagow [ 25 ] 开发的 Tricine-SDS-PAGE 系统的分辨率最高。下面所介绍的方法是在 Bio-Rad 公司的 Protein II 电泳仪（Bio-Rad， Richmond， C A；凝胶尺寸：0.15 cm X 16 cm X 20 cm) 上做的实验，其他公司生产的电泳仪也同样适用。
( 1 ) 剪下一条 BN 胶，室温下将其浸泡在变性处理溶液中 30 min。
( 2 ) 用双蒸水冲洗胶条 30~60 s ( 这一步骤很重要，因为 β-巯基乙醇抑制丙烯酰胺的聚合)。
( 3 ) 将胶条放在电泳仪的玻璃板上的正常胶梳的梳齿位置上。
( 4 ) 再用 1 mm 橡皮密封条、第二块玻璃板和夹子等，组装凝胶电泳仪。将所有需要的东西倒入灌胶器中（与第一向的胶条厚度（1.5 mm) 相比，减少第二向凝胶的厚度到 1.0 mm，以避免第二向胶条沿着垂直方向滑落下去）。
( 5 ) 将 10 ml 的丙烯酰胺溶液、10 ml 的 SDS 凝胶缓冲液、10 ml 双蒸水、100 μl 的 APS 和 10 μl 的 TEMED 混合在一起，配制成 16% 分离胶溶液，将其倒入电泳仪两块玻璃板之间的 BN 胶条以下的空间，为嵌入 BN 胶条的样品胶溶液留下空间。用封胶溶液封胶面，大约 60 min 内凝胶聚合。
( 6 ) 将 4.1 ml 的丙烯酰胺溶液、6.7 ml 的 BN 凝胶缓冲液、2 ml 甘油、200 μl 的 SDS 溶液、6.8 ml 双蒸水、160 μl 的 APS 和 16 μl 的 TEMED 混合在一起，配制成 10% 样品胶溶液。
( 7 ) 倒掉封胶溶液，倒入样品胶将 BN 胶条嵌入，倾斜凝胶架子，使 BN 胶条下面的空气释放出来。
( 8 ) 分别在电泳仪的上、下槽加入 SDS 阳极和阴极电泳缓冲液。
( 9 ) 将电泳仪接上稳压电源，30 mA 电流下，电泳过夜。
作为一个替代系统，第二向电泳可在天然条件下进行（ 见注释 7) 。
3.4 染色
用所有的标准蛋白质染色方法可以显色 2D BN 凝胶上分离的蛋白质，如考马斯亮蓝染色、银染、荧光染料染色等。如果接着用质谱仪鉴定蛋白质，建议使用考马斯亮蓝染色，下面介绍由 Nenhoff 等开发的基于胶态考马斯亮蓝染色的实验指导。
( 1 ) 将凝胶在固定液中固定处理 1 h。
( 2 ) 混合 80 ml 新鲜配制的染色液和 20 ml 乙醇溶液。
( 3 ) 将凝胶浸泡在上述溶液中过夜。
( 4 ) 用双蒸水冲洗凝胶，脱色，要中途换水直至背景清晰（如果背景颜色无法用水脱除，可使用 20% 的乙醇溶液脱色）。
来源：丁香实验
