材料与仪器
细胞核
PMSF
培养基 有机玻璃容器
PMSF
培养基 有机玻璃容器
步骤
1. 准备细胞核。
2. 准备修订培养基，当在冷的条件下强力混合培养基时，在所有修订培养基中加入终浓度为 1 mmol/L 的 PMSF。
3. 用 H2O 按 1:1 稀释 2% 修订培养基 7.5 ml。
4. 将带有夹子的柔性管连接到聚甲基丙烯酸甲酯有机玻璃容器底部的中心孔和带一通阀的注射器上，另一边也带有夹子的柔性管连接到注射器的三通阀和梯度发生器上。
5. 装置建立中所有管道是空的，夹子应夹上一确定梯度发生器贮液槽水平，活塞关闭。
6. 用 3% 和 6% 的修订培养基装满梯度发生器的贮液槽，梯度将从 3% 到 6% 形成，所以要确定将 3% 修订培养基放入梯度发生器的混合贮液槽中。先不要混合梯度。
7. 用 3% 的修订培养基赶走梯度发生器和注射器之间管中的空气，完成后夹上夹子。倒去注射器中的 3% 培养基。
8. 用 1% 的覆盖液赶走注射器和聚甲基丙烯酸甲酯有机玻璃容器之间管中的空气，当注射器空了后，夹上夹子。
9. 用吊桶式转头在 0~4℃ 将细胞核于 2000~3000 g 离心 5 分钟。用 Dounce 匀浆器在 12~20 ml 2% 修订培养基 A 中重悬。
10.将匀浆过的细胞核加入注射器中，打开夹子，让细胞和缓慢流进容器中。
11. 加 2% 的修订培养基到注射器中，将残留的细胞核冲洗干净。夹上夹子。
12. 将 3% 到 6% 的修订培养基梯度注入聚甲基丙烯酸甲酯有机玻璃容器中。
13. 控制梯度流速，应足够慢，以免容器中液体混合。
14. 当梯度完成后，夹上夹子。
15. 细胞核于 0~4℃ 在容器中安定 15~16 小时。
16. 用 50 ml 的圆锥形离心管收集组分，容器底部到顶部。
17. 1500 g 离心组分 10 分钟。弃上清。搅拌片状沉淀，重悬。
18. 甲基绿染色后，用显微镜分析组分。
19. 集合相近的组分，计数细胞核以作参考。
2. 准备修订培养基，当在冷的条件下强力混合培养基时，在所有修订培养基中加入终浓度为 1 mmol/L 的 PMSF。
3. 用 H2O 按 1:1 稀释 2% 修订培养基 7.5 ml。
4. 将带有夹子的柔性管连接到聚甲基丙烯酸甲酯有机玻璃容器底部的中心孔和带一通阀的注射器上，另一边也带有夹子的柔性管连接到注射器的三通阀和梯度发生器上。
5. 装置建立中所有管道是空的，夹子应夹上一确定梯度发生器贮液槽水平，活塞关闭。
6. 用 3% 和 6% 的修订培养基装满梯度发生器的贮液槽，梯度将从 3% 到 6% 形成，所以要确定将 3% 修订培养基放入梯度发生器的混合贮液槽中。先不要混合梯度。
7. 用 3% 的修订培养基赶走梯度发生器和注射器之间管中的空气，完成后夹上夹子。倒去注射器中的 3% 培养基。
8. 用 1% 的覆盖液赶走注射器和聚甲基丙烯酸甲酯有机玻璃容器之间管中的空气，当注射器空了后，夹上夹子。
9. 用吊桶式转头在 0~4℃ 将细胞核于 2000~3000 g 离心 5 分钟。用 Dounce 匀浆器在 12~20 ml 2% 修订培养基 A 中重悬。
10.将匀浆过的细胞核加入注射器中，打开夹子，让细胞和缓慢流进容器中。
11. 加 2% 的修订培养基到注射器中，将残留的细胞核冲洗干净。夹上夹子。
12. 将 3% 到 6% 的修订培养基梯度注入聚甲基丙烯酸甲酯有机玻璃容器中。
13. 控制梯度流速，应足够慢，以免容器中液体混合。
14. 当梯度完成后，夹上夹子。
15. 细胞核于 0~4℃ 在容器中安定 15~16 小时。
16. 用 50 ml 的圆锥形离心管收集组分，容器底部到顶部。
17. 1500 g 离心组分 10 分钟。弃上清。搅拌片状沉淀，重悬。
18. 甲基绿染色后，用显微镜分析组分。
19. 集合相近的组分，计数细胞核以作参考。
来源：丁香实验
