材料与仪器
HBSS 胰酶溶液 胶原溶液
解剖显微镜 不锈钢深盘 Dumom 5 号钳子 柳叶刀 精细弹簧剪 纸巾 大烧杯 试管架 移液管 血细胞计数板
解剖显微镜 不锈钢深盘 Dumom 5 号钳子 柳叶刀 精细弹簧剪 纸巾 大烧杯 试管架 移液管 血细胞计数板
步骤
器材准备
1. 在培养室实验台上放置下列物品：
解剖显微镜
表面和透射照明用的显微镜灯泡
装有 70% 酒精的带盖不锈钢深盘
Dumom 5 号钳子，至少两把
柳叶刀 4 把
精细弹簧剪一把
洗瓶，内装 75% 酒精
纸巾
盛装废弃鸡蛋的大烧杯
垫放培养皿的纸巾
100 mm X 20 mm 的培养皿
装有 Polytowel 的加盖不锈钢盘
放大倍数 100 （物镜X目镜）的组合显微镜，计数细胞用
2. 在培养室超净台上放置下列物品：
本生灯
可倾斜摆放 15 ml 试管的试管架
盒子，内装：离心管，加有棉花塞的巴斯德吸管，吸球
独立包装的移液管 1 ml、5 ml 和 10 ml
泵
血细胞计数板
Hank 氏平衡盐溶液（HBSS）及无 Ca2+ 无 Mg2+ 的 HBSS
2.5% 胰酶溶液
2 个装有一半体积 HBSS 的 35 mm 规格的培养皿
25 ml 规格的烧瓶
(1) 把几张 lens 纸剪成 2 英寸X2.5 英寸的小长方形，以 Swinny 滤器支持板为模板把一叠滤纸剪成圆片，并在超净台中用乙醚洗涤，前后共 2 小时，换 2~3 次乙醚溶液。
(2) 用无水乙醇洗涤 2 小时，其间换液 2~3 次。
(3) 用蒸馏水洗膜 5~10 遍并浸入水中过夜。
(4) 取一盖玻片，部分插入水中，用小钳子把圆纸片拖上盖玻片，然后纸片朝上放在超净台的纸巾上直至纸片干燥为止。
(5) 将上述小圆纸片连同盖玻片一同放进密闭的培养皿中保存，或用小钳子小心将小圆纸片揭下单独保存。
(6) 装 Swinney 滤器。按如下顺序先装下半部：垫圈，滤膜支持物，lens 纸片，O 型垫圈及滤器上半部，上下两部分先松松地拧在一起。
(7) 在凸出的出料口处插入一支 18# 或更大规格的针头。放进培养皿中，贴上高压灭菌带置 Fast-dry 中高压灭菌。
(8) 使用：拧紧滤器，安上注射器推进杆。
3. 超净台中准备胶原包被的组织培养平皿
(1) 融化胶原溶液（Life Technologies）：4℃ 过夜或 37℃ 水浴 15 分钟。
(2) 制作涂布器：煤气火焰加热融化巴斯德吸管头部，在其后 1/2 英寸处加热直至融化弯成直角，晾凉待用。
(3) 往培养板上滴数滴胶原液。35 mm 规格的平板需要 1~2 滴，100 mm 规格的平板需要 3~4 滴。
(4) 用涂布器把胶原涂布均匀，务必使边缘也布满。
收集和解剖胚胎
4. 用 70% 酒精擦拭实验台面，解剖镜和灯放在一侧。
5. 铺纸巾，上放一排培养皿，一个用以盛放收集到的胚胎，其余的放置开过口的鸡蛋。
6. 装废弃鸡蛋的烧杯也就近搁置。
7. 小心地捏着无菌毛巾的折边从盒中取出放在计数板上，折边向远离你的一边。捏着毛巾的长边边缘小心打开。从酒精中拿出器械，注意尖头向上，然后尖头朝折边放在毛巾上，再重新盖好。
8. 用 70% 的酒精擦拭或喷淋 11 日龄的鸡蛋，然后敲碎，放进培养皿中。用钳子轻轻夹着胚胎颈部，垂直拎出放在另一个培养皿中。以同样的方式收集所有的胚胎。若是死胎，全扔掉，包括培养皿。
9. 胚胎移至解剖镜下，光强度至最小的表面光线，用镊子把胸部皮肤剥离。
10. 用两把钳子固定住胚胎，从胸腔肋骨处剪开肌肉，先紧贴并沿着胸骨方向切一口，再一直切到翅膀连接处，肌肉一离开附着点立即收缩，紧贴并沿着胸腔肋骨切一小口一直拉至翅膀连接使肌肉完全脱离下来，放进装有 HBSS 溶液的 35 mm 培养皿中，以同样的方式分离另一半胸肌肉组织。
11. 所有肌肉收集完后，于解剖镜下检查。解剖镜配上比第9步更大功率的透射光源。
12. 清理完全部肌肉后，把培养皿放在解剖镜平台上，操两把解剖刀将肌肉组织切成 1 mm3 见方的块。巴斯德吸管套上橡皮吸球吸些 HBSS 溶液入培养皿。
13. 挑起组织块并转移至一烧杯内，杯中装有 10 ml 用 HBSS 溶液配制的 0.25% 胰酶。该酶无钙和镁离子。铝箔包住烧杯口放进 37℃ 二氧化碳温箱中孵育 20~30 分钟。
胰酶消化细胞
14. 将上述肌肉组织转移至一离心管中，在医用离心机上中等转速离心 2~3 分钟使肌肉组织刚好能沉入管底，不要离心太久形成坚实的团块。
15. 小心将胰酶倒入一无菌培养皿中。
16. 离心管中加入 2 ml 肌肉细胞用培养基（8:1:1）。
17. 先查看一下加棉塞的巴斯德吸管尖头，保证光滑均匀无裂口，套上吸球吸些许培养基浸润其内壁。然后插到离心管底，轻轻吹打。
18. 加入 3 ml 8:1:1 培养基，稍加吹打让细胞分散均匀，然后通过了 lens 滤纸的 Swinney 滤器过滤至一新管中。
计数、接种细胞
19. 计数细胞。
20. 每只 35 mm 规格的培养皿细胞接种密度是 3X105 细胞/ml，共 1.5 ml。大量培养时，如用 100 mm 规格的培养皿，通常每只培养皿接种 10 ml 的 5X105 细胞/ml 的细胞。
21. 于 37℃，5% CO2 水套式温箱中培养细胞。头三天，每天更换培养基，以后，隔一天换一次。
1. 在培养室实验台上放置下列物品：
解剖显微镜
表面和透射照明用的显微镜灯泡
装有 70% 酒精的带盖不锈钢深盘
Dumom 5 号钳子，至少两把
柳叶刀 4 把
精细弹簧剪一把
洗瓶，内装 75% 酒精
纸巾
盛装废弃鸡蛋的大烧杯
垫放培养皿的纸巾
100 mm X 20 mm 的培养皿
装有 Polytowel 的加盖不锈钢盘
放大倍数 100 （物镜X目镜）的组合显微镜，计数细胞用
2. 在培养室超净台上放置下列物品：
本生灯
可倾斜摆放 15 ml 试管的试管架
盒子，内装：离心管，加有棉花塞的巴斯德吸管，吸球
独立包装的移液管 1 ml、5 ml 和 10 ml
泵
血细胞计数板
Hank 氏平衡盐溶液（HBSS）及无 Ca2+ 无 Mg2+ 的 HBSS
2.5% 胰酶溶液
2 个装有一半体积 HBSS 的 35 mm 规格的培养皿
25 ml 规格的烧瓶
(1) 把几张 lens 纸剪成 2 英寸X2.5 英寸的小长方形，以 Swinny 滤器支持板为模板把一叠滤纸剪成圆片，并在超净台中用乙醚洗涤，前后共 2 小时，换 2~3 次乙醚溶液。
(2) 用无水乙醇洗涤 2 小时，其间换液 2~3 次。
(3) 用蒸馏水洗膜 5~10 遍并浸入水中过夜。
(4) 取一盖玻片，部分插入水中，用小钳子把圆纸片拖上盖玻片，然后纸片朝上放在超净台的纸巾上直至纸片干燥为止。
(5) 将上述小圆纸片连同盖玻片一同放进密闭的培养皿中保存，或用小钳子小心将小圆纸片揭下单独保存。
(6) 装 Swinney 滤器。按如下顺序先装下半部：垫圈，滤膜支持物，lens 纸片，O 型垫圈及滤器上半部，上下两部分先松松地拧在一起。
(7) 在凸出的出料口处插入一支 18# 或更大规格的针头。放进培养皿中，贴上高压灭菌带置 Fast-dry 中高压灭菌。
(8) 使用：拧紧滤器，安上注射器推进杆。
3. 超净台中准备胶原包被的组织培养平皿
(1) 融化胶原溶液（Life Technologies）：4℃ 过夜或 37℃ 水浴 15 分钟。
(2) 制作涂布器：煤气火焰加热融化巴斯德吸管头部，在其后 1/2 英寸处加热直至融化弯成直角，晾凉待用。
(3) 往培养板上滴数滴胶原液。35 mm 规格的平板需要 1~2 滴，100 mm 规格的平板需要 3~4 滴。
(4) 用涂布器把胶原涂布均匀，务必使边缘也布满。
收集和解剖胚胎
4. 用 70% 酒精擦拭实验台面，解剖镜和灯放在一侧。
5. 铺纸巾，上放一排培养皿，一个用以盛放收集到的胚胎，其余的放置开过口的鸡蛋。
6. 装废弃鸡蛋的烧杯也就近搁置。
7. 小心地捏着无菌毛巾的折边从盒中取出放在计数板上，折边向远离你的一边。捏着毛巾的长边边缘小心打开。从酒精中拿出器械，注意尖头向上，然后尖头朝折边放在毛巾上，再重新盖好。
8. 用 70% 的酒精擦拭或喷淋 11 日龄的鸡蛋，然后敲碎，放进培养皿中。用钳子轻轻夹着胚胎颈部，垂直拎出放在另一个培养皿中。以同样的方式收集所有的胚胎。若是死胎，全扔掉，包括培养皿。
9. 胚胎移至解剖镜下，光强度至最小的表面光线，用镊子把胸部皮肤剥离。
10. 用两把钳子固定住胚胎，从胸腔肋骨处剪开肌肉，先紧贴并沿着胸骨方向切一口，再一直切到翅膀连接处，肌肉一离开附着点立即收缩，紧贴并沿着胸腔肋骨切一小口一直拉至翅膀连接使肌肉完全脱离下来，放进装有 HBSS 溶液的 35 mm 培养皿中，以同样的方式分离另一半胸肌肉组织。
11. 所有肌肉收集完后，于解剖镜下检查。解剖镜配上比第9步更大功率的透射光源。
12. 清理完全部肌肉后，把培养皿放在解剖镜平台上，操两把解剖刀将肌肉组织切成 1 mm3 见方的块。巴斯德吸管套上橡皮吸球吸些 HBSS 溶液入培养皿。
13. 挑起组织块并转移至一烧杯内，杯中装有 10 ml 用 HBSS 溶液配制的 0.25% 胰酶。该酶无钙和镁离子。铝箔包住烧杯口放进 37℃ 二氧化碳温箱中孵育 20~30 分钟。
胰酶消化细胞
14. 将上述肌肉组织转移至一离心管中，在医用离心机上中等转速离心 2~3 分钟使肌肉组织刚好能沉入管底，不要离心太久形成坚实的团块。
15. 小心将胰酶倒入一无菌培养皿中。
16. 离心管中加入 2 ml 肌肉细胞用培养基（8:1:1）。
17. 先查看一下加棉塞的巴斯德吸管尖头，保证光滑均匀无裂口，套上吸球吸些许培养基浸润其内壁。然后插到离心管底，轻轻吹打。
18. 加入 3 ml 8:1:1 培养基，稍加吹打让细胞分散均匀，然后通过了 lens 滤纸的 Swinney 滤器过滤至一新管中。
计数、接种细胞
19. 计数细胞。
20. 每只 35 mm 规格的培养皿细胞接种密度是 3X105 细胞/ml，共 1.5 ml。大量培养时，如用 100 mm 规格的培养皿，通常每只培养皿接种 10 ml 的 5X105 细胞/ml 的细胞。
21. 于 37℃，5% CO2 水套式温箱中培养细胞。头三天，每天更换培养基，以后，隔一天换一次。
来源：丁香实验
