原理
本方案描述通过与 mRNA 驱动方杂交，继之以羟基磷灰石层析纯化单链放射性标记的 cDNA，制备扣除 cDNA 探针。
材料与仪器
反转录酶 反转录酶缓冲液 驱动方 mRNA 模板 mRNA
乙酸铵 DTT EDTA 乙醇 HCl 异丁醇 NaOH 酚 氯仿 胎盘 RNA 酶抑制剂 SDS SDS EDTA 溶液 磷酸盐缓冲液 SPS 缓冲液 dNTP 溶液
沸水浴 冰水浴 矿物油 Sephadex G-50 柱 微量离心管 水浴或加热板
乙酸铵 DTT EDTA 乙醇 HCl 异丁醇 NaOH 酚 氯仿 胎盘 RNA 酶抑制剂 SDS SDS EDTA 溶液 磷酸盐缓冲液 SPS 缓冲液 dNTP 溶液
沸水浴 冰水浴 矿物油 Sephadex G-50 柱 微量离心管 水浴或加热板
步骤
一、材料
1. 缓冲液与溶液
乙酸铵（10 mol/L)
DTT (1 mol/L)
EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0)
乙醇
HCl ( 2.5 mol/L)
异丁醇
NaOH ( 3 mol/L)
酚：氯仿（1:1，V/V）
胎盘 RNA 酶抑制剂（20 单位/μl）
SDS ( 10% m/V)
SDS/EDTA 溶液（30 mmol/L EDTA (pH 8.0)，1.2% SDS）
磷酸盐缓冲液（2 mol/L，pH 6.8）
SPS 缓冲液（0.12 mol/L（pH 6.8)，0.1% (m/V) SDS）
Tris-Cl ( 1 mol/L，pH 7.4)
2. 酶与缓冲液
反转录酶
10X 反转录酶缓冲液
3. 核酸与寡核苷酸
dCTP ( 125 μmol/L)
含 dATP、dGTP 和 dTTP 各 20 mmol/L 的 dNTP 溶液
驱动方 mRNA
oligo (dT)12-18
模板 mRNA
4. 放射性化合物
[α-32P] dCTP ( 10 mCi/ml，比活性为 >3000 Ci/mmol)
5. 专用设备
在 60℃ 下用羟基磷灰石层析分离单链和双链核酸的装置
沸水浴
冰水浴
矿物油，尖部拉长的可接到自动进样器上的吸头，或硅化的一次性 20 μl 玻璃毛细管、锉刀或钻石刀
Sephadex G-50 柱（5 ml)，用 TE ( pH 8.0）平衡
Sephadex G-50 离心柱，用含 0.1% SDS 的 TE ( pH 8.0）平衡
硅化的微量离心管（1.5 ml）
预热至 45℃、68℃ 和 70℃ 的水浴或加热板
二、方法
1. 将 5~10 μg poIy(A)+ RNA 转移到一个灭菌的微量离心管，用无 RNA 酶的水将 poIy(A)+ RNA 的体积调至 40 μl。盖紧管盖，70℃ 加热 5 min，然后迅速将微量管移至冰水浴。
2. 向冷却的微量管中加入：
0.1 mol/L DTT 2.5 μl
胎盘 RNA 酶抑制剂 200 单位
oligo (dT)12-18 10 μl
10X 反转录缓冲液 25 μl
20 mmol/L dGTP、dATP、dTTP 溶液 10 μl
125 μmol/L dCTP 10 μl
10 mCi/ml [α-32P] dCTP
( 比活性为 > 3000 Ci/mmol) 100 μl
无 RNA 酶的水 加至 240 μl
反转录酶（2000 单位） 10 μl
轻敲管外壁以混合各组分，微量离心机内稍加离心以收集管底的反应混合物，45℃ 下温育反应 1 h。
3. 加入以下试剂以终止反应：
0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 10 μl
10% (m/V) SDS 10 μl
'混匀管中的试剂。
4. 向反应管中加入 30 μl 3 mol/L NaOH。于 68℃ 温育反应混合物 30 min 以水解 RNA。
5. 冷却反应混合物至室温，加入 100 μl 1 mol/L Tris-Cl (pH 7.4) 中和溶液，混匀，然后加 30 μl 2.5 mol/L HCl。在 pH 纸上点一小滴（< 1 μl）溶液检测其 pH。
6. 用酚：氯仿抽提纯化 cDNA。
7. 用 TCA 沉淀法或 DE-81 滤膜结合法检测放射性标记的 dNTP 掺入的比例。按以下公式计算 cDNA 的产率：
在含 1.5 nmol 限量 dNTP 的反应中：
8. 通过 5 ml Sephadex G-50 柱层析分离放射性标记的探针与未掺人的 dNTP。
9. 在放射性标记的 cDNA 中，加入 10 倍重量的驱动方 RNA，用来扣除 cDNA 探针，并加入 0.2 体积的 10 mol/L 乙酸铵和 2.5 体积的冰冷乙醇。于 0℃ 放置 10~15 min，然后在微量离心机中以最大速度在 4℃ 下离心 5 min 回收核酸。
10. 吸去所有的乙醇，敞开管盖，置于试验台上使剩余的乙醇蒸发。将核酸溶于 6 μl 无 RNA 酶的水中。
11. 在溶解的核酸中加入：
2 mol/L 磷酸钠（pH 6.8) 2 μl
SDS/EDTA 溶液 2 μl
12. 用一滴轻矿物油覆盖于溶液上或将混合物吸入硅化的一次性 20 μl 玻璃毛细管，并在本生灯火焰上封住毛细管两端。
13. 将微量离心管或封口的毛细管放入沸水浴中 5 min，再移至 68℃ 水浴杂交，直至 Cr0t = 1000 mol·s/L。
14. 从水浴中取出微量离心管或毛细管。用一个尖部拉长的吸头连到微量进样器上，从微量离心管中吸出杂交液，或用锉或钻石笔打开毛细管的一端，将杂交反应液转移到含有 1 ml SPS 缓冲液的管中。
15. 在 60℃ 下通过羟基磷灰石层析分离单链和双链核酸。
16. 合并含单链 cDNA 的各组分，用异丁醇反复抽提浓缩：加等量异丁醇，漩涡振荡混匀两相，室温下以最大速度在微量离心机中离心 2 min，弃上（有机）相。反复用异丁醇抽提，直到水相体积 <100 μl。
17. 通过以含 0.1% SDS 的 TE ( pH 8.0) 平衡的 Sephadex G-50 离心柱层析，去除 cDNA 中的盐。
18. 检测样品中的放射性量，计算扣除探针中 DNA 的重量。
19. 重复步骤 9~18。
10%~30% 的 cDNA 将在第二轮杂交中与驱动方 RNA 形成杂交体。
1. 缓冲液与溶液
乙酸铵（10 mol/L)
DTT (1 mol/L)
EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0)
乙醇
HCl ( 2.5 mol/L)
异丁醇
NaOH ( 3 mol/L)
酚：氯仿（1:1，V/V）
胎盘 RNA 酶抑制剂（20 单位/μl）
SDS ( 10% m/V)
SDS/EDTA 溶液（30 mmol/L EDTA (pH 8.0)，1.2% SDS）
磷酸盐缓冲液（2 mol/L，pH 6.8）
SPS 缓冲液（0.12 mol/L（pH 6.8)，0.1% (m/V) SDS）
Tris-Cl ( 1 mol/L，pH 7.4)
2. 酶与缓冲液
反转录酶
10X 反转录酶缓冲液
3. 核酸与寡核苷酸
dCTP ( 125 μmol/L)
含 dATP、dGTP 和 dTTP 各 20 mmol/L 的 dNTP 溶液
驱动方 mRNA
oligo (dT)12-18
模板 mRNA
4. 放射性化合物
[α-32P] dCTP ( 10 mCi/ml，比活性为 >3000 Ci/mmol)
5. 专用设备
在 60℃ 下用羟基磷灰石层析分离单链和双链核酸的装置
沸水浴
冰水浴
矿物油，尖部拉长的可接到自动进样器上的吸头，或硅化的一次性 20 μl 玻璃毛细管、锉刀或钻石刀
Sephadex G-50 柱（5 ml)，用 TE ( pH 8.0）平衡
Sephadex G-50 离心柱，用含 0.1% SDS 的 TE ( pH 8.0）平衡
硅化的微量离心管（1.5 ml）
预热至 45℃、68℃ 和 70℃ 的水浴或加热板
二、方法
1. 将 5~10 μg poIy(A)+ RNA 转移到一个灭菌的微量离心管，用无 RNA 酶的水将 poIy(A)+ RNA 的体积调至 40 μl。盖紧管盖，70℃ 加热 5 min，然后迅速将微量管移至冰水浴。
2. 向冷却的微量管中加入：
0.1 mol/L DTT 2.5 μl
胎盘 RNA 酶抑制剂 200 单位
oligo (dT)12-18 10 μl
10X 反转录缓冲液 25 μl
20 mmol/L dGTP、dATP、dTTP 溶液 10 μl
125 μmol/L dCTP 10 μl
10 mCi/ml [α-32P] dCTP
( 比活性为 > 3000 Ci/mmol) 100 μl
无 RNA 酶的水 加至 240 μl
反转录酶（2000 单位） 10 μl
轻敲管外壁以混合各组分，微量离心机内稍加离心以收集管底的反应混合物，45℃ 下温育反应 1 h。
3. 加入以下试剂以终止反应：
0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 10 μl
10% (m/V) SDS 10 μl
'混匀管中的试剂。
4. 向反应管中加入 30 μl 3 mol/L NaOH。于 68℃ 温育反应混合物 30 min 以水解 RNA。
5. 冷却反应混合物至室温，加入 100 μl 1 mol/L Tris-Cl (pH 7.4) 中和溶液，混匀，然后加 30 μl 2.5 mol/L HCl。在 pH 纸上点一小滴（< 1 μl）溶液检测其 pH。
6. 用酚：氯仿抽提纯化 cDNA。
7. 用 TCA 沉淀法或 DE-81 滤膜结合法检测放射性标记的 dNTP 掺入的比例。按以下公式计算 cDNA 的产率：
在含 1.5 nmol 限量 dNTP 的反应中：
8. 通过 5 ml Sephadex G-50 柱层析分离放射性标记的探针与未掺人的 dNTP。
9. 在放射性标记的 cDNA 中，加入 10 倍重量的驱动方 RNA，用来扣除 cDNA 探针，并加入 0.2 体积的 10 mol/L 乙酸铵和 2.5 体积的冰冷乙醇。于 0℃ 放置 10~15 min，然后在微量离心机中以最大速度在 4℃ 下离心 5 min 回收核酸。
10. 吸去所有的乙醇，敞开管盖，置于试验台上使剩余的乙醇蒸发。将核酸溶于 6 μl 无 RNA 酶的水中。
11. 在溶解的核酸中加入：
2 mol/L 磷酸钠（pH 6.8) 2 μl
SDS/EDTA 溶液 2 μl
12. 用一滴轻矿物油覆盖于溶液上或将混合物吸入硅化的一次性 20 μl 玻璃毛细管，并在本生灯火焰上封住毛细管两端。
13. 将微量离心管或封口的毛细管放入沸水浴中 5 min，再移至 68℃ 水浴杂交，直至 Cr0t = 1000 mol·s/L。
14. 从水浴中取出微量离心管或毛细管。用一个尖部拉长的吸头连到微量进样器上，从微量离心管中吸出杂交液，或用锉或钻石笔打开毛细管的一端，将杂交反应液转移到含有 1 ml SPS 缓冲液的管中。
15. 在 60℃ 下通过羟基磷灰石层析分离单链和双链核酸。
16. 合并含单链 cDNA 的各组分，用异丁醇反复抽提浓缩：加等量异丁醇，漩涡振荡混匀两相，室温下以最大速度在微量离心机中离心 2 min，弃上（有机）相。反复用异丁醇抽提，直到水相体积 <100 μl。
17. 通过以含 0.1% SDS 的 TE ( pH 8.0) 平衡的 Sephadex G-50 离心柱层析，去除 cDNA 中的盐。
18. 检测样品中的放射性量，计算扣除探针中 DNA 的重量。
19. 重复步骤 9~18。
10%~30% 的 cDNA 将在第二轮杂交中与驱动方 RNA 形成杂交体。
来源：丁香实验
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