原理
下述的通用操作方案适用于小鼠、大鼠、仓鼠和鸡胚胎。选择大约一半足孕时间的胚胎最好，10~13天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞，成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。图4.1显示了小鼠胚胎的取出和解剖，图4.2显示的是鸡胚胎的取出过程。
材料与仪器
步骤
1) 胚胎的分离。
适用哺乳动物（仓鼠、小鼠和大鼠）
a. 采用认可的方案处死啮齿动物。
b. 立即在无菌超净台内用 70% 乙醇擦洗整个动物。若可能，置紫外灯下照射 5 分钟。
c. 用无菌的镊了和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。
d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宮，置于无菌的培荞皿上。
e. 剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌 PBS 的烧瓶中。
f. 漂洗胚胎，去掉 PBS。继续用 PBS 漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。
适用鸡胚胎
a. 用 70% 乙醇擦洗鸡蛋壳。
b. 用无菌剪刀轻敲鸡蛋的圆端，轻轻去除蛋壳露出气囊。
c. 用无菌摄子去除覆盖于绒毛尿囊上的白膜。
d. 剪开包膜，用弯镊夹住胚胎颈部取出胚胎。
e. 弃头部，将无头的胚胎置于广口烧杯中，用 PBS 漂洗。
2) 将 6~8 个胚胎转移至一个小的无菌广口烧杯屮，用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎,
用 PBS 漂洗。
3) 在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一 500 ml 的无菌的有搅拌棒的烧杯中，加人
200~300 ml 用 HBSS 配制的 0.25％ 的无菌胰蛋白酶（CIBCO/BRL)。
4) 在温暖的环境中或置于 37°C 培养箱中轻轻搅动 15 分钟。
5) 让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含冇悬浮细胞的液体转移至一无菌大容积的离心管中，该管内按照每 10 ml 上清加人 1 ml 牛血清的比例加人牛血淸以灭活胰蛋白酶。
6) 加人新鲜胰蛋白酶溶液（见前述步骤）于含有残留未消化组织块的 500 ml 烧杯中，重复步骤 4 和 5。
7) 离心混合的细胞悬液，1200r/min，5 分钟，弃上清。
8) 用新鲜的无菌 PBS 重悬沉淀的细胞，按步骤 7 再次离心。
9) 用 PBS 反复洗涤细胞至上清清亮为止。
即用含有 10% 牛血清和抗生素（如青霉素、链霉素）的 DMEM(CIBCO/BRL)10 ml 再悬沉淀，并使终体积为 100 ml。
11) 让残留的大块未破碎的组织或特殊颗粒物质沉降。
可采用数层无菌纱布过滤细胞悬液以去除任何残留的细胞块。
12) 为确定现有细胞浓度，加人 0.2 ml 細胞悬液于 1.8 ml1% 醋酸溶液中以裂解红细胞，用血细胞计数器进行细胞计数（见第 2 节中的"细胞计数")
13) 按每 10 mm 平皿 1x10 7 至 4x107 细胞的数量接种于 10 ml 组织培养液 中，在饱和湿度的 C02 培养箱中孵育直至细胞铺满。
14) 当细胞长满后，去除培养液，用 10% 的温暖的 Versene（用 PBS 配制的 0.53 mmol/L EDTA,GIBCO/BRL) 洗涤细胞层 2 次。
15) 弃 Versene，加人相同体积的温暖化 0.05% 胰蛋白酶-EDTA(GIBCO/BRL)
16)37°C 孵育 5 分钟
17) 用无菌吸管轻轻吹散细胞，并转移至一含 1~2 ml 牛血清的无菌管中。
18) 离心，1200/min,5 分钟，弃上清。
19) 再悬沉淀于 5 ml 培养液屮（见上文），另加人 15 ml 培养液，分装于 2 个 100 mm 平皿中。
20) 置 37°C 饱和湿度的 C02 培养箱中培养细胞，直至细胞长满，继续步骤 14~20 以传代细胞。
适用哺乳动物（仓鼠、小鼠和大鼠）
a. 采用认可的方案处死啮齿动物。
b. 立即在无菌超净台内用 70% 乙醇擦洗整个动物。若可能，置紫外灯下照射 5 分钟。
c. 用无菌的镊了和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。
d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宮，置于无菌的培荞皿上。
e. 剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌 PBS 的烧瓶中。
f. 漂洗胚胎，去掉 PBS。继续用 PBS 漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。
适用鸡胚胎
a. 用 70% 乙醇擦洗鸡蛋壳。
b. 用无菌剪刀轻敲鸡蛋的圆端，轻轻去除蛋壳露出气囊。
c. 用无菌摄子去除覆盖于绒毛尿囊上的白膜。
d. 剪开包膜，用弯镊夹住胚胎颈部取出胚胎。
e. 弃头部，将无头的胚胎置于广口烧杯中，用 PBS 漂洗。
2) 将 6~8 个胚胎转移至一个小的无菌广口烧杯屮，用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎,
用 PBS 漂洗。
3) 在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一 500 ml 的无菌的有搅拌棒的烧杯中，加人
200~300 ml 用 HBSS 配制的 0.25％ 的无菌胰蛋白酶（CIBCO/BRL)。
4) 在温暖的环境中或置于 37°C 培养箱中轻轻搅动 15 分钟。
5) 让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含冇悬浮细胞的液体转移至一无菌大容积的离心管中，该管内按照每 10 ml 上清加人 1 ml 牛血清的比例加人牛血淸以灭活胰蛋白酶。
6) 加人新鲜胰蛋白酶溶液（见前述步骤）于含有残留未消化组织块的 500 ml 烧杯中，重复步骤 4 和 5。
7) 离心混合的细胞悬液，1200r/min，5 分钟，弃上清。
8) 用新鲜的无菌 PBS 重悬沉淀的细胞，按步骤 7 再次离心。
9) 用 PBS 反复洗涤细胞至上清清亮为止。
即用含有 10% 牛血清和抗生素（如青霉素、链霉素）的 DMEM(CIBCO/BRL)10 ml 再悬沉淀，并使终体积为 100 ml。
11) 让残留的大块未破碎的组织或特殊颗粒物质沉降。
可采用数层无菌纱布过滤细胞悬液以去除任何残留的细胞块。
12) 为确定现有细胞浓度，加人 0.2 ml 細胞悬液于 1.8 ml1% 醋酸溶液中以裂解红细胞，用血细胞计数器进行细胞计数（见第 2 节中的"细胞计数")
13) 按每 10 mm 平皿 1x10 7 至 4x107 细胞的数量接种于 10 ml 组织培养液 中，在饱和湿度的 C02 培养箱中孵育直至细胞铺满。
14) 当细胞长满后，去除培养液，用 10% 的温暖的 Versene（用 PBS 配制的 0.53 mmol/L EDTA,GIBCO/BRL) 洗涤细胞层 2 次。
15) 弃 Versene，加人相同体积的温暖化 0.05% 胰蛋白酶-EDTA(GIBCO/BRL)
16)37°C 孵育 5 分钟
17) 用无菌吸管轻轻吹散细胞，并转移至一含 1~2 ml 牛血清的无菌管中。
18) 离心，1200/min,5 分钟，弃上清。
19) 再悬沉淀于 5 ml 培养液屮（见上文），另加人 15 ml 培养液，分装于 2 个 100 mm 平皿中。
20) 置 37°C 饱和湿度的 C02 培养箱中培养细胞，直至细胞长满，继续步骤 14~20 以传代细胞。
注意事项
注意事项
以此种方式培养的细胞传代许多次均生长良好，在前儿次传代后，仅成纤维样细胞可存活，可按第2节的方法进行细胞的冻存。
以此种方式培养的细胞传代许多次均生长良好，在前儿次传代后，仅成纤维样细胞可存活，可按第2节的方法进行细胞的冻存。
来源：丁香实验
