单层细胞的胰蛋白酶处理

下述方案描述的是釆用胰蛋白酶处理细胞，进行细胞的传代或收集。维持细胞系的方法通常为每周传代一次，在传代的前一天换培养液；但是某些细胞系需要更频繁的传代。每种细胞系应单独传代以免细胞系交叉污染。超净工作台内不能同时放置个以上细胞系。

1) 吸干培养单层细胞的细胞培养瓶或培养皿中的培养液。

2) 加入 0.05% 胰蛋白酶工作液（T-25 细胞培养瓶加入 1 ml；T-75 细胞培养瓶加入 3 ml)。

无菌的 10x 或 1x 胰蛋白酶/EDTA 工作液可从 Life Technologies 购买或按照下列配方配制：

胰蛋白酶 1x 工作液（0.05%)

胰蛋白酶/EDTA 10x 储存液       100 ml
NaCl                   7.1g
KCl                      0.4 g
葡萄糖                1.0 g
NaHCO₃            0.35 g
1% 酚红             1.0ml
H₂O                    900 ml

调节 pH 至 7.2
小心：KCl, 酚红

胰蛋白酶/EDTA 10X 储存液
胰蛋白酶（1:250)          5.0 g
EDTA•四钠盐                  2.0 g
NaCl                                0.85 g
H₂O                                 100 ml

-20°C 储存胰蛋白酶/EDTA10x 储存液和 1x 工作液。小量分装物可置 4°C 保存 1~2周。胰蛋白酶放置于 37°C 的时间应尽可能缩短以免胰蛋白酶降解、酶活性下降，

3) 快速地前后旋转细胞培养瓶 4~5 次以便胰蛋白酶包被所有瓶内细胞，并且痕量的培养液及血清得到稀释。

4) 检查细胞，不要待细胞脱落后才吸除胰蛋白酶工作液。

5) 另加 1~3 ml 胰蛋白酶工作液，再旋转细胞培养瓶 4-5 次。

6) 注意在细胞尚未脱落前吸除胰蛋内酶工作液。

7) 将细胞培养瓶盖松松拧上后置细胞培养瓶于 37°C 培养箱中 2~5 分钟。

8) 用手轻拍细胞培养瓶使得瓶内的少量液体能够带下已经要脱壁的细胞，检查细胞脱落情况。苦无细胞脱落将细胞培养瓶再放冋 37°C 培养箱中孵育数分钟。继续轻拍细胞培养瓶直至细胞完全脱落。

9) 再悬细胞于细胞培养液内（2~5 ml/T-25 细胞培养瓶)。

10) 轻轻吹打细胞使得团状细胞分散，以需要的细胞密度接种细胞。

注意事项

• 如果采用含有 EDTA 螯合剂的溶液作为预洗液，该传代方案中胰蛋白酶的用量可减少。在此种情况下，步骤 2 可作修改，因为采用不含胰蛋白酶的预洗液。

预洗液

EDTA. 四钠盐               2.0 g
NaCl                             8.0 g
KCl                                0.4 g
葡萄糖                          1.0g
NaHCO₃                      0.35 g
1% 酚红                       1 ml
H₂O                              900 ml

调节 pH 至 7.2

• 对于对胰蛋白酶不很敏感的细胞系，下面的快速胰蛋白酶处理方案可供选择

a. 用 PBS 洗涤单层细胞。

b. 加人足够量的 lx 胰蛋白酶工作液以覆盖所有细胞，37°C 孵育 5 分钟。

c. 检查细胞脱落情况，吸取胰蛋白酶工作液屮的细胞，用培养液稀释至欲接种的细胞数。