原理
本方案是 Kupiec 等所述方法(1987) 的改良版本,包括用蛋白酶 K 消化细胞和组织,用高浓度甲酰胺分离 DNA-蛋白质复合物(染色质用火棉胶袋充分透析去除蛋白酶和有机溶剂等过程。甲酰胺是一种离子化溶剂,能分离蛋白质-DNA 复合物并使蛋白变性和释放,但他并不明显影响蛋白酶 K 的活性。用本程序制备的基因组 DNA 很大 7200 kb,适于用高包装容量载体构建文库及通过脉冲凝胶电泳分析大片段 DNA。本方法有两个缺点:比其他方法需要更多的时间;所制备 DNA 的最终浓度颇低(约 10 μg/ml )。从 1X108 培养的非整倍体哺乳类细胞(如 HeLa 细胞)中大约可制备 1 mg 高分子质量 DNA。
材料与仪器
λ 噬菌体的线性单体和多联体 哺乳类细胞 新鲜组织 血样
透析缓冲液 甲酰胺变性缓冲液 TE
脉冲电场凝胶或 0.6% 琼脂糖凝胶 带有不锈钢杯的搅拌器 火棉胶袋 尖头去除的黄色尖头 透析管夹 玻璃棒 水浴或孵箱
透析缓冲液 甲酰胺变性缓冲液 TE
脉冲电场凝胶或 0.6% 琼脂糖凝胶 带有不锈钢杯的搅拌器 火棉胶袋 尖头去除的黄色尖头 透析管夹 玻璃棒 水浴或孵箱
步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
透析缓冲液 1(20 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0),0.1 moI/L NaCl,10 mmol/L EDTA ( pH 8.0),制备 6 L 透析缓冲液 1,储于 4℃。)
透析缓冲液 2(10 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0),10 mmol/L NaCl,0.5 mmol/L EDTA ( pH 8.0),制备 6 L 透析缓冲液 2,储于 4℃。)
甲酰胺变性缓冲液(20 mmol/L Tris-Cl ( pH 8.0),0.8 mol/L NaCI,80% (V/V) 甲酰胺)
TE ( pH 8.0)
2. 凝胶
脉冲电场凝胶或 0.6% 琼脂糖凝胶
3. 核酸和寡核苷酸
λ 噬菌体的线性单体和多联体
4. 专用设备
带有不锈钢杯的搅拌器(用于组织)
火棉胶袋
尖头去除的黄色尖头
透析管夹
玻璃棒
预置于 15℃ 的水浴或孵箱
预罝于 50℃ 的水浴
5. 细胞和组织
单层或悬浮培养的哺乳类细胞,或新鲜组织,或血样
二、方法
1. 采用方案 1 步骤 1~4 制备细胞悬液(或冰冻细胞粉末)的裂解液。
2. 将含有裂解细胞和裂解缓冲液的溶液冷却至 15℃。每 1 ml 细胞裂解液加 1.25 ml 甲酰胺变性缓冲液,用玻璃棒温和地混匀溶液。将溶液在 15℃ 放置 12 h。
3. 将黏滞的溶液灌入一个或者多个火棉胶袋中。透析袋开口用透析管夹封住,在 4℃ 于 2 L 裂解缓冲液 1 中透析 45 min。换新鲜缓冲液 1 并继续透析至少 4 h 后,再换 2 L 新鲜透析缓冲液 1 透析另外 4 h。将 DNA 在 2 L 新鲜透析缓冲液 2 中透析 3 次,每次至少 4 h。
4. 测定 DNA 的浓度。
5. 脉冲凝胶电泳或者常规的 0.6% 琼脂糖凝胶电泳。用 λDNA 单体或者线性多联体作为分子质量标记。基因组 DNA 大小将超过 200 kb。
1. 缓冲液和溶液
透析缓冲液 1(20 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0),0.1 moI/L NaCl,10 mmol/L EDTA ( pH 8.0),制备 6 L 透析缓冲液 1,储于 4℃。)
透析缓冲液 2(10 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0),10 mmol/L NaCl,0.5 mmol/L EDTA ( pH 8.0),制备 6 L 透析缓冲液 2,储于 4℃。)
甲酰胺变性缓冲液(20 mmol/L Tris-Cl ( pH 8.0),0.8 mol/L NaCI,80% (V/V) 甲酰胺)
TE ( pH 8.0)
2. 凝胶
脉冲电场凝胶或 0.6% 琼脂糖凝胶
3. 核酸和寡核苷酸
λ 噬菌体的线性单体和多联体
4. 专用设备
带有不锈钢杯的搅拌器(用于组织)
火棉胶袋
尖头去除的黄色尖头
透析管夹
玻璃棒
预置于 15℃ 的水浴或孵箱
预罝于 50℃ 的水浴
5. 细胞和组织
单层或悬浮培养的哺乳类细胞,或新鲜组织,或血样
二、方法
1. 采用方案 1 步骤 1~4 制备细胞悬液(或冰冻细胞粉末)的裂解液。
2. 将含有裂解细胞和裂解缓冲液的溶液冷却至 15℃。每 1 ml 细胞裂解液加 1.25 ml 甲酰胺变性缓冲液,用玻璃棒温和地混匀溶液。将溶液在 15℃ 放置 12 h。
3. 将黏滞的溶液灌入一个或者多个火棉胶袋中。透析袋开口用透析管夹封住,在 4℃ 于 2 L 裂解缓冲液 1 中透析 45 min。换新鲜缓冲液 1 并继续透析至少 4 h 后,再换 2 L 新鲜透析缓冲液 1 透析另外 4 h。将 DNA 在 2 L 新鲜透析缓冲液 2 中透析 3 次,每次至少 4 h。
4. 测定 DNA 的浓度。
5. 脉冲凝胶电泳或者常规的 0.6% 琼脂糖凝胶电泳。用 λDNA 单体或者线性多联体作为分子质量标记。基因组 DNA 大小将超过 200 kb。
来源:丁香实验