原理
BAC 重组子的精细分析，包括详细的限制酶切图谱、DNA 测序或亚克隆，所需 DNA 量都超过小量制备所能提供的量。本方案的制备流程适用于重组 BAC 的大规模培养物。500 ml BAC 转化菌的平均产量为 20~25 μg BAC DNA。还可用柱层析对 DNA 产物进一步纯化。
材料与仪器
溶菌酶 限制性内切核酸酶 DNA 标准参照物 层析树脂 大肠杆菌
乙醇 异丙醇 DNA提取液 碱性裂解液 STE溶液 TE
脉冲场凝胶电泳仪 LB 培养基 Sorvall GSA 转头或同类产品
乙醇 异丙醇 DNA提取液 碱性裂解液 STE溶液 TE
脉冲场凝胶电泳仪 LB 培养基 Sorvall GSA 转头或同类产品
步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
乙醇
异丙醇
酚: 氯仿（1:1, V/V)
DNA 提取液
碱性裂解液Ⅰ，预冷
碱性裂解液Ⅱ
碱性裂解液Ⅲ，预冷
STE 溶液，预冷
TE ( pH 8.0)
2. 酶和缓冲液
溶菌酶
限制性内切核酸酶
3. 核苷酸与寡核苷酸
脉冲场凝胶电泳的 DNA 标准参照物
4. 凝胶
脉冲场凝胶电泳仪
5. 培养基
含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 培养基
6. 离心机与转头
Sorvall GSA 转头或同类产品，备有 Oakridge 管（Nalgene)
7. 专用设备
层析树脂
8. 载体和菌株
BAC 转化的大肠杆菌
二、方法
1. 将 50 μl 过夜培养的饱和 BAC 转化菌接种到 500 ml 含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 培养基中，37℃ 剧烈振荡（300 r/min) 培养 12~16 h 至细胞达到饱和。
2. 4℃ 下，2500 g（Sorvall GSA 转头 3900 r/min）离心 15 min，收集细胞，弃上清，倒置离心瓶使最后一滴上清流尽。
3. 用 100 ml 冰预冷的 STE 重新悬浮细菌沉淀。按步骤 2 方法离心收集细菌。
4. 用 24 ml 含无 DNase 的 RNA 酶（100 μg/ml ) 的碱性裂解液Ⅰ溶解细菌。加溶菌酶至终浓度为 1 mg/ml。
5. 加入 24 ml 新鲜配制的碱性裂解液Ⅱ。盖紧离心瓶盖，轻轻翻转瓶子数次，使内容物完全混匀，冰浴 5 min。
6. 加入 24 ml 冰预冷的碱性裂解液Ⅲ，盖紧离心瓶盖，轻轻涡旋离心瓶使内容物完全混匀，至无明显的两相分层现象，置冰上 5 min。
7. 4℃ 下，15000 g（Sorvall GSA 转头 9600 r/min）离心细菌裂解液 10 min，然后将上清转移至另一聚丙烯离心瓶中。弃去离心瓶中的沉淀。
8. 加等体积的酚：氯仿。轻轻翻转离心瓶数次，混匀水相和有机相。室温下 3000 g ( Sorvall GSA 转头 4300 r/min ) 离心 15 min，使两相分离。
9. 用一宽口径吸头将水相移至一新离心瓶中，加入等体积的异丙醇，翻转离心瓶数次，混匀。
10. 在离心瓶的一侧做标记，并且将有标记的一侧放在远离转头中心的一面。此标记有助于接下来确定核酸沉淀的位置。室温下 15000 g ( Sorvall GSA 转头 9600 r/min) 离心 15 min, 回收核酸沉淀。
11. 小心弃去上清，将离心瓶倒立在一纸中上，至最后一滴上清流尽。室温下用 20 ml 70% 乙醇漂洗沉淀和管壁。吸干乙醇，室温下将瓶倒立在一叠纸巾上几分钟，使乙醇挥发殆尽。
12. 小心地将 BAC DNA 沉淀溶于 0.2 ml TE ( pH 8.0) 中。轻弹管壁而不要在涡旋仪上振荡，以促进 DNA 溶解。通过光谱吸收测 DNA 浓度。
13. 用限制性内切核酸酶消化 DNA。
14. 用 PFGE 分析消化的 BAC DNA。电泳要采用适宜大小的 DNA 标准参照物。
1. 缓冲液和溶液
乙醇
异丙醇
酚: 氯仿（1:1, V/V)
DNA 提取液
碱性裂解液Ⅰ，预冷
碱性裂解液Ⅱ
碱性裂解液Ⅲ，预冷
STE 溶液，预冷
TE ( pH 8.0)
2. 酶和缓冲液
溶菌酶
限制性内切核酸酶
3. 核苷酸与寡核苷酸
脉冲场凝胶电泳的 DNA 标准参照物
4. 凝胶
脉冲场凝胶电泳仪
5. 培养基
含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 培养基
6. 离心机与转头
Sorvall GSA 转头或同类产品，备有 Oakridge 管（Nalgene)
7. 专用设备
层析树脂
8. 载体和菌株
BAC 转化的大肠杆菌
二、方法
1. 将 50 μl 过夜培养的饱和 BAC 转化菌接种到 500 ml 含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 培养基中，37℃ 剧烈振荡（300 r/min) 培养 12~16 h 至细胞达到饱和。
2. 4℃ 下，2500 g（Sorvall GSA 转头 3900 r/min）离心 15 min，收集细胞，弃上清，倒置离心瓶使最后一滴上清流尽。
3. 用 100 ml 冰预冷的 STE 重新悬浮细菌沉淀。按步骤 2 方法离心收集细菌。
4. 用 24 ml 含无 DNase 的 RNA 酶（100 μg/ml ) 的碱性裂解液Ⅰ溶解细菌。加溶菌酶至终浓度为 1 mg/ml。
5. 加入 24 ml 新鲜配制的碱性裂解液Ⅱ。盖紧离心瓶盖，轻轻翻转瓶子数次，使内容物完全混匀，冰浴 5 min。
6. 加入 24 ml 冰预冷的碱性裂解液Ⅲ，盖紧离心瓶盖，轻轻涡旋离心瓶使内容物完全混匀，至无明显的两相分层现象，置冰上 5 min。
7. 4℃ 下，15000 g（Sorvall GSA 转头 9600 r/min）离心细菌裂解液 10 min，然后将上清转移至另一聚丙烯离心瓶中。弃去离心瓶中的沉淀。
8. 加等体积的酚：氯仿。轻轻翻转离心瓶数次，混匀水相和有机相。室温下 3000 g ( Sorvall GSA 转头 4300 r/min ) 离心 15 min，使两相分离。
9. 用一宽口径吸头将水相移至一新离心瓶中，加入等体积的异丙醇，翻转离心瓶数次，混匀。
10. 在离心瓶的一侧做标记，并且将有标记的一侧放在远离转头中心的一面。此标记有助于接下来确定核酸沉淀的位置。室温下 15000 g ( Sorvall GSA 转头 9600 r/min) 离心 15 min, 回收核酸沉淀。
11. 小心弃去上清，将离心瓶倒立在一纸中上，至最后一滴上清流尽。室温下用 20 ml 70% 乙醇漂洗沉淀和管壁。吸干乙醇，室温下将瓶倒立在一叠纸巾上几分钟，使乙醇挥发殆尽。
12. 小心地将 BAC DNA 沉淀溶于 0.2 ml TE ( pH 8.0) 中。轻弹管壁而不要在涡旋仪上振荡，以促进 DNA 溶解。通过光谱吸收测 DNA 浓度。
13. 用限制性内切核酸酶消化 DNA。
14. 用 PFGE 分析消化的 BAC DNA。电泳要采用适宜大小的 DNA 标准参照物。
来源：丁香实验
