原理
从不同大肠杆菌菌株中获得的 P1 噬菌体 DNA 的产量与质量取决于宿主菌的基因型和重组子中外源 DNA 的特定序列。将 P1 或 PAC 重组子转化到不表达 Cre 重组酶的大肠杆菌菌株中有时可以解决低产或劣质的问题(如 NS3516; Sternberg et al. 1994)。
材料与仪器
限制性内切核酸酶 闭环重组 P1 DNA 电转感受态大肠杆菌细胞
琼脂糖凝胶 LB 琼脂平板 SOC 培养基 电穿孔仪
琼脂糖凝胶 LB 琼脂平板 SOC 培养基 电穿孔仪
步骤
一、材料
1. 酶与缓冲液
限制性内切核酸酶
2. 凝胶
琼脂糖凝胶
3. 培养基
含 25 μg/ml 卡那霉素的 LB 琼脂平板
SOC 培养基
含 25 μg/ml 卡那霉素的 TB 培养基
4. 专用设备
电穿孔仪
5. 载体和菌株
闭环重组 P1 DNA
冷冻保存的电转感受态大肠杆菌细胞(如 DH10B )
二、方法
1. 用无菌水将 2~3 μg P1 质粒 DNA 稀释至 60 ng/μl。设一不含 P1 DNA 的对照样品 (无菌水),在电穿孔时作为平行对照。.
2. 将电转感受态细胞置于冰上融化。预冷 0.1 cm 电穿孔杯。
3. 将 20 μl 细胞与 1 μl P1 DNA 在预冷的电穿孔杯中混合。
4. 将电穿孔仪设为 1.8 kV, 200 Ω,25 μF。
5. 电击细胞,最佳时间常数通常约为 5 ms。
6. 立即向细胞悬液中加入 0.5 ml 预热至 37℃ 的 SOC 培养基。将悬液转移至一培养管中,37℃ 中度振荡培养 1 h。
7. 将 100 μl 的细胞悬液涂布于含 25 μg/ml 卡那霉素的 LB 平板上,37℃ 温育过夜。
8. 将 10~12 个菌落分别置于 11 ml 含 25 μg/ml 卡那霉素的 TB 培养液中。37℃ 剧烈振荡,培养过夜。
9. 制备 P1 DNA。
10. 用不同限制性内切核酸酶进行酶切,经琼脂糖凝胶电泳比较新提取的 DNA 与原始重组子 DNA 的酶切图谱。
1. 酶与缓冲液
限制性内切核酸酶
2. 凝胶
琼脂糖凝胶
3. 培养基
含 25 μg/ml 卡那霉素的 LB 琼脂平板
SOC 培养基
含 25 μg/ml 卡那霉素的 TB 培养基
4. 专用设备
电穿孔仪
5. 载体和菌株
闭环重组 P1 DNA
冷冻保存的电转感受态大肠杆菌细胞(如 DH10B )
二、方法
1. 用无菌水将 2~3 μg P1 质粒 DNA 稀释至 60 ng/μl。设一不含 P1 DNA 的对照样品 (无菌水),在电穿孔时作为平行对照。.
2. 将电转感受态细胞置于冰上融化。预冷 0.1 cm 电穿孔杯。
3. 将 20 μl 细胞与 1 μl P1 DNA 在预冷的电穿孔杯中混合。
4. 将电穿孔仪设为 1.8 kV, 200 Ω,25 μF。
5. 电击细胞,最佳时间常数通常约为 5 ms。
6. 立即向细胞悬液中加入 0.5 ml 预热至 37℃ 的 SOC 培养基。将悬液转移至一培养管中,37℃ 中度振荡培养 1 h。
7. 将 100 μl 的细胞悬液涂布于含 25 μg/ml 卡那霉素的 LB 平板上,37℃ 温育过夜。
8. 将 10~12 个菌落分别置于 11 ml 含 25 μg/ml 卡那霉素的 TB 培养液中。37℃ 剧烈振荡,培养过夜。
9. 制备 P1 DNA。
10. 用不同限制性内切核酸酶进行酶切,经琼脂糖凝胶电泳比较新提取的 DNA 与原始重组子 DNA 的酶切图谱。
来源:丁香实验