原理
萤光素酶是理想的报告基因,因为哺乳动物细胞中不含内源性萤光素酶,一旦转录完成立刻就生成功能性的萤光素酶,同时在所有的化学发光反应中,它的光产物具有最高的量子效率,检测灵敏度高。荧光素酶报告基因被广泛用于miRNA靶基因验证。
荧光素酶报告基因的原理在于miRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用,可以将目的基因3’UTR区域构建至pGL3-basic载体中报告基因Luciferase的后面,构建荧光素酶质粒。然后转染至细胞中,通过比较过表达或者干扰miRNA后,检测报告基因表达的改变(监测萤光素酶的活性变化)可以定量反映miRNA对目的基因的抑制作用。结合定点突变等方法进一步确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。
材料与仪器
细胞裂解缓冲液 荧光素酶测定缓冲液 荧光素溶液 不含钙盐和镁盐的磷酸盐缓冲液
荧光光度计和光度计测置管 橡胶棒
步骤
1. 转染后 24-72 h, 室温下用不含钙盐和镁盐的磷酸盐缓冲液(PBS) 洗细胞 3 次。PBS 换液时要轻缓,因为有些哺乳动物细胞(如人胎肾 293 细胞)在剧烈吹打时很容易从培养皿上脱落下来。通常,荧光素酶基因在转染细胞中获得最大表达量的时间是 24-72 h。
2. 每个 100 mm 培养皿中的转染细胞,加入 lml 冰冷的裂解缓冲液。缓冲液轻轻旋转, 然后用橡胶棒把裂解细胞从培养皿上刮下来。细胞裂解物转移到 1.5 ml 离心管中。
3. 细胞裂解物在 4°C 以最大速度离心 5 min。把上清小心地转移到另一个新的 1.5 ml 离心管中。
4. 用 Bradford 测定等快速比色法确定裂解物的蛋白浓度。在测定蛋白浓度前,为了防止干扰,把 TritonX-100 的浓度稀释到小于等于 0.1%。这步中,细胞裂解液可以分成小份, 贮存在-70°C。虽然贮存在或-20°C 时,荧光素酶在裂解缓冲液中不稳定(Brasier et al.1989), 但是在含 15%(V/V)甘油和 1%(m/V) 牛血淸白蛋白的缓冲液中,该酶可以在 4°C 安全贮存。
5. 敲打盛有裂解物的管子的管壁,轻轻使裂解物混合。室温下,在每个含有 360ul 荧光素酶测定缓冲液的荧光光度计管中加入 5-200ul 细胞裂解液。管子放入荧光光度计。
除了可使用荧光光度计测量荧光素酶活性,还有另一种方法在栏目替代方案:用闪烁计数器测量荧光素酶活性。
6. 测定开始,200ul 荧光素溶液加到荧光光度计管中,然后在室温测量 2-60s 时间内的光输出。測光输出时间的最佳长短要根据经验确定,而且与转染细胞的类型以及所用的特殊底物和荧光素酶有关。
7. 测定每个管子产生的相对光单位数,并确定测量的线性范围。使用适当量的细胞裂解蛋白,使它在随后测量中产生的值位于线性范围的中部。根据所研究启动子的强度以及每次实验的转染效率,所需蛋白的量会有变化。细胞裂解物中荧光素酶活性可以用相对光单位数或毫克表示。
注意事项
常见问题
来源于分子克隆实验指南(第三版)下册
来源:丁香实验